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酵母單雜交技術(shù)的原理、基本操作和用途
點擊次數(shù)：1509 發(fā)布時間：2016-9-7
酵母單雜交技術(shù)是一種研究蛋白質(zhì)和特定DNA序列相互作用的技術(shù)方法，主要包括四個流程即：一、篩選還有報告基因的酵母單細胞株；二、構(gòu)建表達文庫；三、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細胞；四、陽性克隆菌株的篩選。
1.酵母單雜交的基本原理
酵母單雜交技術(shù)是1993年由酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來的，其基本原理為：真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個DNA特異性結(jié)合功能域和一個或多個其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可*獨立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。
酵母單雜交技術(shù)的原理、基本操作和用途
酵母單雜交原理示意圖
2.酵母單雜交技術(shù)的特點
酵母單雜交體系自1993年由Wang和Reed創(chuàng)立以來，在生物學(xué)研究領(lǐng)域中已經(jīng)顯示出巨大的威力。應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)驗證了許多已知的DNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用，同時發(fā)現(xiàn)了新的DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，并由此找到了多種新的轉(zhuǎn)錄因子。近來，已有應(yīng)用酵母單雜交體系進行疾病診斷的研究報道。隨著酵母單雜交體系的不斷發(fā)展和完善，它在科研、醫(yī)療等方面的應(yīng)用將會越來越廣泛。采用酵母單雜交體系能在一個簡單實驗過程中，識別與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時可直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列，而無需分離純化蛋白，實驗簡單易行。由于酵母單雜交體系檢測到的與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)是處于自然構(gòu)象，克服了體外研究時蛋白質(zhì)通常處于非自然構(gòu)象的缺點，因而具有很高的靈敏性。目前，多種酵母單雜交體系的試劑盒和相應(yīng)的cdna文庫已經(jīng)商品化，為酵母單雜交體系的使用提供了有利的條件。
但酵母單雜交也存在以下缺點：有時由于插入的靶元件與酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活因子可能發(fā)生相互作用，或插入的靶元件不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，因此往往產(chǎn)生假陽性結(jié)果。如果酵母表達的AD融合蛋白對細胞有毒性，或融合蛋白在宿主細胞內(nèi)不能穩(wěn)定地表達，或融合蛋白發(fā)生錯誤折疊，或者不能定位于酵母細胞核內(nèi)，以及融合的Gal4AD封閉了蛋白質(zhì)上與DNA相互作用的位點，則都可能干擾AD融合蛋白結(jié)合于靶元件的能力，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3.酵母單雜交的基本操作過程
(1)設(shè)計含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入酵母細胞。
(2)將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人同一酵母中。
(3)若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達將文庫蛋白的編碼基因篩選出來。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結(jié)合蛋白。
4.酵母單雜交技術(shù)的用途
迄今為止，應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)識別并驗證了許多與目的DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時單雜交技術(shù)還被應(yīng)用于識別金屬反應(yīng)結(jié)合因子。正向與反向單雜交體系的結(jié)合，還可用于篩選阻礙DNA與蛋白質(zhì)相互作用的突變的單個核苷酸。
目前，在研究DNA—蛋白質(zhì)相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：①確定已知DNA—蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用;②分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因;③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及準確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。
酵母單雜交是在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的技術(shù)，酵母單雜交主要用于研究蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，而酵母雙雜交主要是用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用。