上海士鋒生物科技有限公司

ELISA試劑盒,進口,中檢所標(biāo)準(zhǔn)品,生物試劑,培養(yǎng)基,中間體

化工儀器網(wǎng)收藏該商鋪

13

聯(lián)系電話

13122441390

 QQ交談      小標(biāo) 您所在位置:首頁 > 公司動態(tài)> 基因轉(zhuǎn)染之磷酸鈣-DNA共沉淀技術(shù)
產(chǎn)品搜索

請輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字:

環(huán)境類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

藥品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品

抗生素

試劑盒

標(biāo)準(zhǔn)品

生物試劑

培養(yǎng)基

PCR相關(guān)產(chǎn)品

細胞相關(guān)試劑

Omega Biotek

金標(biāo)試劑盒

標(biāo)準(zhǔn)菌株

抗體

檢測、檢驗試劑

食品安全檢測試劑盒

聯(lián)系方式
地址:上海市寶山區(qū)錦樂路
郵編:200431
聯(lián)系人:王小姐
電話:021-56640936
傳真:021-33250231
手機:13122441390 15900755943
留言:發(fā)送留言
個性化:www.shifengsj.com
網(wǎng)址:www.shfeng-edu.com
商鋪:http://true-witness.com/st236594/
公司動態(tài)

基因轉(zhuǎn)染之磷酸鈣-DNA共沉淀技術(shù)

點擊次數(shù):971 發(fā)布時間:2016-9-13

實驗原理:核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時,可使DNA附在細胞表面,利于細胞吞入攝取,或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內(nèi),進入細胞的DNA僅有1%~5%可以進入細胞核中,其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合,在細胞中進行穩(wěn)定表達,基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4,這項技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1過濾,4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE:0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養(yǎng)基:用含10%胎牛血清的Dmem培養(yǎng)液配制G418,G418濃度為200~ 800mg/L

注意:對受體細胞先做預(yù)試驗,選用濃度為在10~14天內(nèi)能殺死細胞50%以上的zui低濃度。

2、操作步驟[方法一]:

(1)供體DNA制備:方法按前介紹的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L。

(2)受體細胞的培養(yǎng):研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等,該細胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向,一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細胞,接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2培養(yǎng),待細胞占50~70%瓶底面積時,用于轉(zhuǎn)染試驗。

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同時向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1~2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中,緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。

③然后立即混旋,室溫下靜置30分鐘,待溶液輕度混濁后,吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細胞。

(4)轉(zhuǎn)染受體細胞

①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50~70%的受體細胞,在轉(zhuǎn)染前4小時更換一次新鮮培養(yǎng)基,每瓶5ml(25ml培養(yǎng)瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀,加入含5mL培養(yǎng)液的細胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h或更長,使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。

④更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進行篩選。同時設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細胞。

⑥培養(yǎng)大約3~5天,對照細胞大部分死亡,這時轉(zhuǎn)染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基,每3~4天更換一次選擇培養(yǎng)基。

⑦2周后對照細胞死亡,在轉(zhuǎn)染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現(xiàn),待其增大后再進行克隆化和擴大培養(yǎng),可建立轉(zhuǎn)化細胞株,并做進一步鑒定。

本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細胞,這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性,這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”,也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的,可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的基因組DNA導(dǎo)入受體細胞即可,其方法如下:

3、基因組DNA轉(zhuǎn)染[方法二]:

(1)配制磷酸轉(zhuǎn)染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時現(xiàn)配,pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?/p>

加溫水至 1000mL

(2)按前面介紹的方法提取癌細胞基因組DNA。

(3)取供體基因組DNA50~100μg,加3M NaCl或醋酸鈉,使zui終濃度至0.3M混勻。

(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘,去上清。

(5)加入轉(zhuǎn)染緩沖液,待DNA充分溶解后,再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM,用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結(jié)),置室溫下10~30分鐘,待液體透明度降低,出現(xiàn)微濁蘭色時,即可用于轉(zhuǎn)染細胞。 (6)取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生長期細胞,在轉(zhuǎn)染前4小時,更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。

(7)轉(zhuǎn)染:向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5~1mL/瓶,置37℃作用4~6小時。

(8)培養(yǎng):棄去培養(yǎng)液,用15%甘油處理3分鐘,無血清培養(yǎng)漂洗1次,接近匯合時血清用量降至5%,培養(yǎng)2~3周。

(9)檢測:逐日觀察,待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后,克隆分離,擴大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細胞株。

脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細胞。

用LR進行轉(zhuǎn)染時,首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細胞適合的用量、作用時間等,對每批LR都要做:*,先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間,DNA可從1~5μg和孵育時間6小時開始,按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線,再選用LR和DNA兩者*的劑量,確定出轉(zhuǎn)染時間(2~24小時)。因LR對細胞有一定的毒性,轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。

細胞種類:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

1、操作步驟[方法一]:

(1)細胞培養(yǎng):取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿),向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液,37℃CO2培養(yǎng)至40%~60%匯合時(匯合過分,轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞)。

(2)轉(zhuǎn)染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA,終量100μL,B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR,終量100μL,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象,但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致,應(yīng)酌情減量)。

(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備:用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。

(4)轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意:轉(zhuǎn)染時切勿加血清,血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]:

(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時,使其達到50~60%板底面積。

(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下:

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘,再加入脂質(zhì)體懸液,旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5~10分鐘,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3)棄去細胞中的舊液,用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物,37℃培養(yǎng)3~5小時。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時,

(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培養(yǎng)24~48小時。

(6)用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。

穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下:

(1)接種細胞同前,細胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細胞同前(2)、(3)步驟。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培養(yǎng)48小時。

(4)吸出DMEM,用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細胞,使細胞生長一定時間,篩選轉(zhuǎn)染克隆,方法參照細胞克隆篩選法進行。

DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,其原理還不清楚,可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞核,此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗,轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關(guān)系,可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30分鐘-1.5小時),又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。

方法如下:

(1)接種鼠L成纖維細胞濃度為5×105CO2/孔/皿生長2~3天,當(dāng)達50%板底面積可用。

(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA,空氣干燥后溶于40μL的TE中,或取供體DNA。

(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長因子血清的DMEM洗板(皿)。

(4)在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA,取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細胞中,使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動直到顯示均勻一致的紅色,培養(yǎng)4小時。

(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖,加入5mL 10%DMSD,室溫放置1分鐘,吸出DMSO,用5mL 1×PBS洗一次吸出,加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM)。

(6)培養(yǎng)細胞,在適當(dāng)時間分析細胞,若含有抗藥基因,可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng),方法同前。

[ 打印 ] [ 返回頂部 ] [ 關(guān)閉

| 商鋪首頁 | 公司檔案 | 產(chǎn)品展示 | 供應(yīng)信息 | 公司動態(tài) | 詢價留言 | 聯(lián)系我們 | 會員管理 |
化工儀器網(wǎng) 設(shè)計制作,未經(jīng)允許翻錄必究.Copyright(C) http://true-witness.com, All rights reserved.
以上信息由企業(yè)自行提供,信息內(nèi)容的真實性、準(zhǔn)確性和合法性由相關(guān)企業(yè)負責(zé),化工儀器網(wǎng)對此不承擔(dān)任何保證責(zé)任。
溫馨提示:為規(guī)避購買風(fēng)險,建議您在購買產(chǎn)品前務(wù)必確認(rèn)供應(yīng)商資質(zhì)及產(chǎn)品質(zhì)量。
二維碼 在線交流

掃一掃訪問手機站