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細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)

點(diǎn)擊次數(shù):533 發(fā)布時(shí)間:2016-9-26

細(xì)胞的組織化學(xué)方法,是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物,再通過(guò)顯微鏡對(duì)組織內(nèi)的生物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。 一、Brachet反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA (一)原理 細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后,其中的DNA和RNA出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng),一般認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力,且這兩種染料的作用有選擇性,甲基綠染高聚分子的DNA呈藍(lán)綠色,呱咯寧染低聚分子的RNA呈紅色。由此對(duì)細(xì)胞中的DNA和RNA進(jìn)行定位、定性、和定量分析。 (二)方法 l.接種Hela細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng)24~48小時(shí),使長(zhǎng)成單層。 2.取出蓋片,用PBS(pH7.2)輕輕沖洗蓋片表面去除殘?jiān)?3.放入Carnoy固定液中固定l小時(shí)。 4.浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中30分鐘染色。 5.取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗2~3次(2~3秒鐘左右),吸去水分。放入純丙酮中分色2~3秒鐘。 6. 放入l/2丙酮+1/2二甲苯中5秒鐘。 7.放入純二甲苯中透明5分鐘。8.滴一滴中性樹(shù)膠于載玻片上,將蓋片標(biāo)本面朝下封片。9.鏡下觀察(三)結(jié)果細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色,細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色,而其中核仁被染成紫紅色。二、細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示(一)原理由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同,在pH值不同的溶液中,蛋白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下,整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多,則為酸性蛋白質(zhì);帶正電荷多,則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此,可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后,用不同pH值的固綠染液分別染色,細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來(lái)。(二)方法1.以破壞脊髓法處死蟾蜍,將其腹面向上放人蠟盤(pán)中,剪開(kāi)胸腔,打開(kāi)心包。小心將心臟剪一小口,取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端,推片,按此法制備二張血涂片,室溫晾干。2. 將涂片作好標(biāo)記放在70%乙醇中固定5分鐘,室溫晾干。3.放入5%三氯醋酸中60℃30分鐘,抽提出核酸。4.清水沖洗多次(3分鐘以上),以沖去痕跡的三氯醋酸。5.濾紙吸干玻片上水分。6. 一張片放入0.1%堿性固綠(pH8.0~8.5)中染色10~15分鐘,另一張片放入0.1%酸性固綠(pH2.0~2.5)染色5~10分鐘。7.清水沖洗,蓋上蓋片鏡檢。(三)結(jié)果經(jīng)堿性固綠染色片中,胞質(zhì)、核仁不著色,細(xì)胞核大部分被染成綠色,是為堿性蛋白質(zhì)存在處。經(jīng)酸性固綠染色片中,因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白,被染成綠色。 三、細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶的顯示(一)原理過(guò)氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物,用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本,細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化物酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán),進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物,因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來(lái)判定過(guò)氧化物酶的有無(wú)或多少。(二)方法1.取小鼠一只,以頸椎脫位法將其處死,迅速剖開(kāi)其后肢暴露出股骨,將股骨一端斜向剪斷,用PBS緩沖液濕潤(rùn)過(guò)的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。2.推片,室溫晾干。3.將涂片放入0.5%硫酸銅中浸30秒~1分鐘。4.取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng)6分鐘。5.清水沖洗,放入1%番紅溶液中復(fù)染2分鐘。6.清水沖洗,室溫晾干。7.鏡檢或封片后鏡檢。(三)結(jié)果涂片中可見(jiàn)一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒,為過(guò)氧化物酶所在位置。 四、過(guò)碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)——顯示細(xì)胞內(nèi)糖原 (一)原理 組織、細(xì)胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法來(lái)顯示,其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過(guò)碘酸的氧化作用,打開(kāi)碳鏈形成醛,生成的醛基與Schiff試劑中的無(wú)色品紅反應(yīng)形成紫紅色化合物。 (二)方法 l.取l~2mm厚的肝組織塊,用Carnoy氏液4℃固定4~6小時(shí)。 2.乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋,切片。 3.用70%乙醇展片。 4.脫蠟:二甲苯(1)5分鐘→二甲苯(2)5分鐘→100%乙醇5分鐘→含1%火棉膠的乙醇液1分鐘→70%乙醇1分鐘。 5.直接浸入過(guò)碘酸酒精液反應(yīng)5~15分鐘,經(jīng)70%乙醇洗片刻。6.浸入Schiff氏酒精液反應(yīng)15分鐘。 7.亞硫酸水洗三次,以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素,以及擴(kuò)散的染料。 8.流水沖洗3~5分鐘。 9.蒸餾水洗。 10.浸入Ehrlich蘇木精復(fù)染20~30秒,使細(xì)胞核著色。 11.脫水:95%乙醇3分鐘二次→100%乙醇3分鐘二次→二甲苯透明10分鐘二次。 12.加蓋片鏡檢或樹(shù)膠封固后鏡檢。 (三)結(jié)果 細(xì)胞中呈紫紅的顆粒即為糖原。

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