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線粒體的分離與觀察
點擊次數(shù)：1085 發(fā)布時間：2017-2-16
線粒體(mitochondria)是真核細胞中產(chǎn)生能量的重要細胞器。細胞中的能源物質(zhì)—脂肪、糖、部分氨基酸在此進行zui終的氧化，并通過偶聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。
制備線粒體時，可將組織勻漿液懸浮在懸浮介質(zhì)中進行差速離心法進行分離。在一定的離心場中（選用離心機的一定轉(zhuǎn)速），大小不一的顆粒沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一個均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中zui先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次再分離。
懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在—定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2 的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應(yīng)注意使樣品保持4℃，避免酶失活。
線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。
三、實驗用品
(一) 材料 小鼠12 只
（二）器材 冷凍高速離心機、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍網(wǎng)、玻璃勻漿器、PH 計、高壓滅菌鍋等。
（三）試劑 氯化鈉、詹納斯綠B、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、D(十)蔗糖、
甲醇、冰醋酸、雙蒸水、甘油、姬姆薩染料、KH2PO4 、Na2HPO4。
1．0.9%滅菌的生理鹽水。
2. 1%詹納斯綠B 染液，用0.9%滅菌的生理鹽水配制。
3. 0.25mol/L 蔗糖十0.01mo1/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)：
0.1mol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) 10ml
0.1mol/L 鹽酸8.4ml
加重蒸水到100ml
加蔗糖到0.25mol/L。
4. 0.34mol/L 蔗糖十0.01mol/L tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)
5. 固定液：甲醇：冰醋酸(9：1)
6. 姬姆薩染液（原液）：Giemsa 粉0.5g，甘油33m1，純甲醇33m1。先將Giemsa 粉置于研缽內(nèi)中，加少量甘油研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h 令其充分溶解，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。
7. 姬姆薩染液（應(yīng)用液）：臨用時，吸出1ml 原液，用9ml 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)作l0 倍稀釋。
8. 1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)：
l/15mol/L KH2PO4 50ml
l/15 mol/L Na2HPO4 50ml
四、實驗操作
1. 制備小鼠肝細胞勻漿實驗前小鼠空腹12h，拉頸處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預(yù)冷到0～4℃的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L 緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分數(shù)次添加。勻漿液用200 目銅篩過濾備用。