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培養(yǎng)細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇
點(diǎn)擊次數(shù):1107 發(fā)布時(shí)間:2017-3-20
冷凍保存與復(fù)蘇原理
在低于-70℃的超低溫條件下,有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢,甚至終止。因此,采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒庸潭ㄔ谀骋浑A段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí),其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存,就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件),并在此溫度下對其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存,并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。
水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中,隨著溫度的降低,細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰,所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。
這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中,隨著溫度的降低,細(xì)胞外部的水分會首先結(jié)冰,從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長,細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞,細(xì)胞便發(fā)生滲漏,在復(fù)溫時(shí),大量水分會因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降,細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰,產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑,則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Wo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合,從而降低冰點(diǎn),減少冰晶的形成,并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷,細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí),一般以很快的速度升溫,1-2分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫,細(xì)胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶,也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時(shí)間,從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生,凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。
¨冷凍速率
冷凍速率是指降溫的速度,直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化:當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃時(shí),因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn),細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰;當(dāng)被冷至-5~-15℃之間時(shí),細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是,細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡,會向細(xì)胞外流動。冷凍速度不同,細(xì)胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同:如果冷凍速度慢,細(xì)胞內(nèi)水分外滲多,細(xì)胞脫水,體積縮小,細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高,細(xì)胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰;如果冷凍速度快,細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲,結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰;如果冷凍速度非??欤闯焖倮鋬觯?,則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)(玻璃化冷凍)。Luyet(1973)證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式:一種是晶體化,溶液中的分子呈有序排列;另一種情況是非晶體即玻璃化,液體中的分子呈無序狀態(tài),保持未凝固前的狀態(tài)。
不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化,也可以對細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過慢時(shí),細(xì)胞脫水嚴(yán)重,細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮,超過一定程度時(shí)即失去活性。同時(shí)冷凍速度過慢,還會引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰,從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高,產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時(shí),細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲,會形成較到冰晶,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞,產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細(xì)胞存活來說是zui為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固,無冰晶形成或形成很小的冰晶,對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷,細(xì)胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時(shí)間暴露而受損。
不同細(xì)胞的zui適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的zui適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min和200℃/min。細(xì)胞與細(xì)胞之間的zui適冷凍速率可在1.6℃~300℃/min,故對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前,首先需要測定其zui適冷凍速率,以保證獲得zui高的冷凍存活率。