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酸性磷酸酶(ACP)的顯示實(shí)驗(yàn)

點(diǎn)擊次數(shù):1083 發(fā)布時(shí)間:2017-3-27

目的要求 
1.熟悉酸性磷酸酶顯示方法的原理及操作步驟 
2.觀(guān)察酸性磷酸酶在細(xì)胞中的分布

基本原理
酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)主要存在于巨噬細(xì)胞,定位于溶酶體內(nèi)。在溶酶體膜穩(wěn)定完整時(shí),底物不易滲入,ACP活力微弱或無(wú)活性,經(jīng)固定,在合適pH條件下,膜本身變?yōu)椴环€(wěn)定,逐漸改變其滲透性,底物可以滲入,酶活力被顯示。

ACP在酸性條件下(pH4.7)可使作用液中的底物β-甘油磷酸鈉的磷酸根解離出來(lái),進(jìn)而與溶液中*結(jié)合形成磷酸鉛沉淀,因其是難溶解的無(wú)色沉淀物,需要與黃色的硫化銨作用,生成棕黑色PBS沉淀而被顯示出來(lái)。
β-甘油磷酸鈉→甘油+PO3-
PO4 +Pb(NO3)2→ Pb2(PO4)2
Pb2(PO4)4 +(NH4)2S→PbS

實(shí)驗(yàn)用品
1.器材:注射器、解剖用具、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片
2.試劑:
3%淀粉溶液;ACP作用液;2%硫化銨
3.材料:小鼠腹腔液涂片

免疫動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)前4~6天用無(wú)菌注射器取已滅菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔內(nèi),每天一次。
酸性磷酸酶(ACP)的顯示

頸椎脫臼處死小鼠
酸性磷酸酶(ACP)的顯示

吸取少量腹腔液,在玻片上涂層一薄層,室溫晾干。
酸性磷酸酶(ACP)的顯示

將涂片滴置于溫盒中,滴加適量ACP作用液,37℃作用30分鐘。取出后,蒸餾水漂洗。用10%甲醛鈣溶液后固定5min。
酸性磷酸酶(ACP)的顯示

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