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真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)染方法
點(diǎn)擊次數(shù)：857 發(fā)布時(shí)間：2017-7-10
【1】．DEAE－葡聚糖法
一、實(shí)驗(yàn)材料：
1．50mg/ml DEAE-葡聚糖溶液（500mg DEAE-葡聚糖溶于10ml水，1ml分裝，高壓滅菌，儲(chǔ)存于-20℃） （Sigma）
2．TBS溶液(PH 7.4)
NaCL 8.0g/L
KCL 0.2g/L
Tris 3.0g/L
酚紅 0.015g/L
(HCL調(diào)PH至7.4，定容1L。高壓滅菌。)
3．20％葡萄糖溶液(高壓滅菌，-20℃儲(chǔ)存)
4．PBS (PH 7.4)
二、實(shí)驗(yàn)方法：
1．配置TBS-D溶液
100mlTBS加入20％葡萄糖溶液0.5ml，至終濃度為1％。
2．配置DEAE-dextran-DNA-TBS-D轉(zhuǎn)染液
DEAE-dextran 1mg/ml
DNA(超螺旋) 5-10ug/ml(DNA濃度根據(jù)細(xì)胞種類、細(xì)胞密度及質(zhì)粒種類決定，zui適濃度經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)
轉(zhuǎn)染液數(shù)量根據(jù)細(xì)胞多少?zèng)Q定，一般每瓶細(xì)胞需300ul。
3．以5×105/瓶密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)。
4．細(xì)胞棄培養(yǎng)基, PBS 5ml洗兩遍, TBS-D洗一遍，吸盡殘液。
5．加入轉(zhuǎn)染液，搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其與細(xì)胞充分接觸，放入孵箱溫育20－40分鐘，觀察細(xì)胞至皺縮變圓為止。
6．吸去轉(zhuǎn)染液，TBS-D洗兩遍, PBS洗一遍（動(dòng)作必須輕柔，避免已轉(zhuǎn)染DNA的細(xì)胞脫落），加入10ml全培養(yǎng)基 3％CO2濃度37℃培養(yǎng)。
三．實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定標(biāo)準(zhǔn)：
1．轉(zhuǎn)染有DNA的細(xì)胞一般鏡下觀察顆粒較多，加入抗生素篩選培養(yǎng)，可使未轉(zhuǎn)染DNA的細(xì)胞死亡。
2．如目的DNA為pZ189，可通過(guò)Hirt’s法提取，做轉(zhuǎn)化鑒定。
3．加入氯喹作用或進(jìn)行甘油休克可增加轉(zhuǎn)染效率。
四．參考文獻(xiàn)：
1．Sambrook J et al. Molecular cloning.
2．張小山，浙江醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文。