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DNA芯片檢測(cè)siRNA專一性
點(diǎn)擊次數(shù)：722 發(fā)布時(shí)間：2017-7-18
長(zhǎng)片斷的雙鏈RNA (dsRNA) 導(dǎo)入例如植物，真菌，果蠅，線蟲(chóng)等生物的細(xì)胞中會(huì)引發(fā)同源mRNA的降解——這就是所謂的RNA interference (RNAi)。RNAi分兩個(gè)步驟，首先是長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25個(gè)堿基的small interfering RNAs (sirnas)。這些siRNA隨后和相關(guān)蛋白組合成為RNA-induced silencing complex (RISC) ，這個(gè)復(fù)合物以同源mRNA為靶摧毀mRNA。兩年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功引發(fā)特異基因的沉默，從此siRNA廣泛應(yīng)用于這個(gè)領(lǐng)域。
siRNA介導(dǎo)的基因沉默通常要求高度的序列專一。Tuschl和同事證實(shí)siRNA和mRNA之間一個(gè)堿基的錯(cuò)配都會(huì)導(dǎo)致基因沉默的失敗，當(dāng)然這并不排除由siRNAs 引發(fā)的非特異基因沉默。siRNAs也有可能會(huì)引發(fā)一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超過(guò)30個(gè)堿基的長(zhǎng)片斷dsRNA一樣通過(guò)引發(fā)抗病毒反應(yīng)—— 一種通常由于機(jī)體對(duì)抗病毒入侵產(chǎn)生的反應(yīng)，包括由蛋白激酶R和后繼的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻斷，以及由 RNase L激活的非特異RNA降解。
這就意味著需要在全基因組范圍內(nèi)對(duì)siRNA的專一性進(jìn)行檢測(cè)。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法對(duì)siRNAs的專一性在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行了檢查。
Brown和同事檢查了兩個(gè)針對(duì)外源GFP基因的siRNAs的專一性，結(jié)論是關(guān)閉外源的GFP表達(dá)不會(huì)間接影響其他細(xì)胞內(nèi)源基因的表達(dá)水平。2個(gè)GFP特異的siRNAs和兩個(gè)隨機(jī)無(wú)意序列對(duì)照siRNAs分別被轉(zhuǎn)染能瞬時(shí)或者持續(xù)表達(dá)GFP的人源293細(xì)胞，結(jié)果通過(guò)GFP熒光水平檢測(cè)和FACS分析，GFP特異的siRNAs能夠沉默70%的GFP表達(dá)而對(duì)照則對(duì)GFP表達(dá)沒(méi)有影響。從轉(zhuǎn)染和沒(méi)有轉(zhuǎn)染siRNAs的細(xì)胞中分離RNA，標(biāo)記后和點(diǎn)有36000個(gè)人類基因的cDNA 芯片雜交。其中約有20000個(gè)基因在293細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果表明這20000個(gè)基因中沒(méi)有一個(gè)的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染了特異或非特異siRNAs后發(fā)生顯著變化。
對(duì)于RNAi 特異性的另一個(gè)關(guān)注焦點(diǎn)是：傳遞的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫"secondary siRNAs"的產(chǎn)生。Transitive RNAi是在線蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，也可能在其他生物中發(fā)生。在這個(gè)過(guò)程中，siRNAs，在變性后結(jié)合到互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄本上，通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3"和5"端的延伸形成新的雙鏈dsRNAs。這些dsRNAs被加工成為"secondary siRNAs"。這些二級(jí)siRNAs，如果和其他基因有同源，可以導(dǎo)致其他基因表達(dá)的沉默，這樣就強(qiáng)化了非特異基因沉默的可能性。
到目前為止，在人類基因組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn) RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)，這提示在人類細(xì)胞中可能不會(huì)發(fā)生RNAi傳遞。然而這個(gè)假設(shè)并沒(méi)有被廣泛的驗(yàn)證過(guò)。Brown和同事也檢測(cè)了在人源細(xì)胞中是否存在傳遞RNAi現(xiàn)象。他們將兩個(gè)報(bào)告基因(luciferase and GFP)分別和常見(jiàn)的actin序列融合，共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。他們檢測(cè)到一個(gè)報(bào)告基因的特異的siRNAs不能導(dǎo)致另一個(gè)報(bào)告基因沉默。結(jié)果表明傳遞RNAi機(jī)制在人類中不存在。
研究結(jié)果支持已有的假設(shè)：siRNAs在高度序列專一的條件下發(fā)揮作用，只能導(dǎo)致*互補(bǔ)的基因表達(dá)沉默。人類細(xì)胞不存在傳遞RNAi現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)這種專一性。
不過(guò)實(shí)驗(yàn)受限于細(xì)胞類型和siRNAs類型，特別是外源基因的siRNAs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然有待推廣到其他細(xì)胞類型，特別是內(nèi)源基因的siRNAs，如果siRNAs在將來(lái)要應(yīng)用于基因治療，這樣的實(shí)驗(yàn)將尤為重要。