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RFLP和RAPD技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：813 發(fā)布時(shí)間：2017-8-28
*節(jié)概述
DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段長度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢測，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個(gè)探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點(diǎn)，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。
當(dāng)某個(gè)性狀（基因）與某個(gè)（些）分子標(biāo)記協(xié)同分離時(shí)，表明這個(gè)性狀（基因）與分子標(biāo)記連鎖。分子標(biāo)記與性狀之間交換值的大小，即表示目標(biāo)基因與分子標(biāo)記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內(nèi)切酶與分子標(biāo)記組成不同組合進(jìn)行研究。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標(biāo)記則有幾個(gè)甚至上千個(gè)。分子標(biāo)記越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。
運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA
段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術(shù)誕生的時(shí)間很短,但由于其*的檢測DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡便的特點(diǎn),使這個(gè)技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個(gè))不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對(duì)于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn).這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合pcr擴(kuò)增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3’端相距在一定的長度范圍之內(nèi),就可擴(kuò)增出DNA段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對(duì)PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時(shí)可用的引物數(shù)很大,雖然對(duì)每一個(gè)引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進(jìn)行作圖分析。
本實(shí)驗(yàn)將學(xué)習(xí)RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術(shù)。探針標(biāo)記及雜交檢測方法請(qǐng)另詳見分子雜交技術(shù)。
第二節(jié)RFLP技術(shù)
一、材料
基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。
二、設(shè)備
電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大)4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙，eppendorf管(0.5ml)若干。
三、試劑：
1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
2、5×TBE電泳緩沖液：配方見*章。
3、變性液：0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl。
4、中和液：1mol/LTris·Cl,pH7.5/1.5mol/LNaCl。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/LNaOH，0.2mol/LTris·Cl,pH7.5/2×SSC，ddH2O，Agarose0.8%，0.25mol/LHCl。
四.操作步驟
1.基因組DNA的酶解
(1)大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實(shí)驗(yàn),要求提取的DNA分子量大于50kb,沒有降解。
(2)在50μl反應(yīng)體系中,進(jìn)行酶切反應(yīng):
5μg基因組DNA
5μl10×酶切緩沖液
20單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2O,至50μl