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流式檢測(cè)細(xì)胞樣品的制備

2013-4-24　　閱讀(1637)

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方案A：組織培養(yǎng)細(xì)胞的制備。
方案B：淋巴組織細(xì)胞制備。
方案C：非淋巴組織細(xì)胞制備。
方案D：全血PBMC的分離。

小貼士
1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)需要將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。
2、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。
3、實(shí)體組織制備單細(xì)胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進(jìn)行，具體組織的方法，依照經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行。


方案A: 組織培養(yǎng)細(xì)胞的制備

實(shí)驗(yàn)材料：
Accutase™ 酶細(xì)胞分離培養(yǎng)基 （eBioscience Cat. No. 00-4555）
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實(shí)驗(yàn)流程：
1、如果是懸浮細(xì)胞，則小心將細(xì)胞移入離心管中，進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力分析。進(jìn)行步驟3.
2、如果是貼壁細(xì)胞，建議使用Accutase™ 酶細(xì)胞分離培養(yǎng)基 （eBioscience Cat. No. 00-4555）是細(xì)胞團(tuán)塊分離，制備成單細(xì)胞懸液后置于離心管中計(jì)數(shù)和活力分析。（注意:accutase 可能會(huì)改變某些細(xì)胞表位，應(yīng)該預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察避免其干擾檢測(cè)）
3、300g 離心5min。棄去上清，應(yīng)用適量的流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml。


方案B：淋巴組織細(xì)胞制備。

實(shí)驗(yàn)材料：
60×15mm 的組織培養(yǎng)皿
5ml 注射器
細(xì)胞過(guò)濾器（尼龍網(wǎng)過(guò)濾）
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實(shí)驗(yàn)方案：
1、獲取組織（脾臟，淋巴結(jié)或胸腺）加入5~10ml eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222），使用5ml注射器注射心研磨組織（或采用兩片載玻片研磨亦可）。
2、收集磨碎的細(xì)胞懸液，過(guò)濾至離心管中計(jì)數(shù)和活力分析。
3、300g 離心5min。棄去上清，應(yīng)用適量的流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml。


方案C：非淋巴組織細(xì)胞制備。

剪刀和手術(shù)刀片
剪刀和手術(shù)刀片
PBS
60×15mm 的組織培養(yǎng)皿
5ml 注射器
細(xì)胞過(guò)濾器（尼龍網(wǎng)過(guò)濾）
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實(shí)驗(yàn)流程:
1、獲取組織剪碎或切碎組織為2~4mm碎塊，用PBS稀釋適量的酶進(jìn)行消化（溫度，方法依照酶的說(shuō)明書(shū)）。
2、小心分離細(xì)胞團(tuán)塊，過(guò)濾除去死細(xì)胞和碎片。
3、300g 離心5min，棄去上清。加PBS 5ml 300g 離心5min，棄去上清，重復(fù)一次。計(jì)數(shù)和活力分析。
4、300g 離心5min，棄去上清，應(yīng)用適量的流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml。


方案D：全血PBMC的分離。

實(shí)驗(yàn)材料：
PBS
Ficoll® 淋巴細(xì)胞分離液
eBioscience® 流式染色緩沖液 （eBioscience Cat. No. 00-4222）
15ml或50ml的離心管。

實(shí)驗(yàn)流程：
1、以PBS 1:1稀釋血樣。將血樣輕輕加到2ml Ficoll® 淋巴細(xì)胞分離液或其他品牌亦可。
2、1000g離心20min,小心吸取分離液和PBS之間的霧狀細(xì)胞，即為PBMC。至新的離心管中。
3、4度，300g 離心5min,棄上清。應(yīng)用適量的流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/ml。

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