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【感受態(tài)細胞的制備】 一步法制備感受態(tài)細胞

2013-5-15  閱讀(1489)

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一、操作步驟:

1. 涂平板:為取得*的感受態(tài)效率,必須先把甘油菌或其它形式保存的菌種涂LB平板,并培養(yǎng)過夜。

2. 接種:取一有新鮮培養(yǎng)的菌種的LB平板,后續(xù)操作均在超凈臺內進行。把鑷子的頂端在70%酒精中蘸一下,并在酒精燈上略略燒一下,使鑷子的頂端處于無菌狀態(tài)。用鑷子夾取一個無菌的塑料槍頭或牙簽,從平板上挑取一個單克隆,然后把蘸有菌種的塑料槍頭或牙簽放到裝有3毫升LB的細菌培養(yǎng)試管內。上述操作也可以使用接種環(huán)等進行操作。

3. 培養(yǎng):37℃約200rpm培養(yǎng)過夜,通常培養(yǎng)時間控制在16小時左右為宜。不宜超過18小時。

4. 再接種培養(yǎng):根據(jù)需要制備的感受態(tài)細菌的量,按照1:100的比例用新鮮培養(yǎng)的過夜菌接種培養(yǎng)。例如取500微升的新鮮過夜菌到50毫升的LB中繼續(xù)37℃約200rpm培養(yǎng)。通常在大約培養(yǎng)2-2.5小時后OD600可以達到0.3-0.5。

5. 制備感受態(tài)細菌:在培養(yǎng)的細菌OD600達到0.3-0.5時,4℃2000g離心5分鐘收集細菌。如果離心沉淀前的菌量為50毫升,按后續(xù)操作進行,如果是其它體積則按比例換算后進行后續(xù)操作。用5毫升預冷的LB重新懸浮起細菌沉淀,加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受態(tài)制備試劑,混勻,冰浴放置5分鐘。然后再輕輕混勻,根據(jù)實驗需要適當分裝到1.5毫升或0.5毫升的離心管內后-70℃保存。

注:如果以后會只做單管的轉化,可以分裝成每管zui少50微升或100微升,如果以后一次性做多個轉化,可以每管分裝500微升或更大體積。-70℃保存后,感受態(tài)的效率會隨時間的推移逐漸下降,但通常在半年內使用轉化效率下降不會太多??偟膩碚f,新鮮制備的感受態(tài)要比凍存的感受態(tài)轉化效率更高一些。

二、注意事項:

1. 需自行配制LB液體培養(yǎng)基和LB平板以用于細菌的培養(yǎng)和感受態(tài)效率的檢測。

2. 盡管凡是處于對數(shù)期內的細菌都可以用于感受態(tài)細菌的制備,但如果細菌生長的OD600的值達到0.3-0.5左右時,制備出來的感受態(tài)效果*。

3. 在制備感受態(tài)細菌的過程中均使用不含抗生素的LB。在使用感受態(tài)菌的過程中熱休克后的37℃培養(yǎng)時也必須使用無抗生素的LB,即便轉入的質粒是有抗性的。

4. 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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