1.探針的標(biāo)記：

（1） 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：

待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升）                        2微升

T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X）       1微升

Nuclease-Free Water                                           5微升

[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml）     1微升

T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升）       1微升

總體積                                                                      10微升

按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。

（2） 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。

（3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。

（4） 再加入89微升TE,混勻。此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率。

（5） 標(biāo)記好的探針立即使用，zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

2.探針的純化：

通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時(shí)候，純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

（1） 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。

（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí)，或在-20℃沉淀

（3） 在4℃，12000g-16000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。

（4） 在4℃，12000g-16000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。

（5） 加入100微升TE，*溶解沉淀。標(biāo)記好的探針立即使用，zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃。

3.EMSA膠的配制：

（1） 準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞?。選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。

（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大）。

TBE buffer （10X）                                                   1毫升

重蒸水                                                                          16.2毫升

39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v）       2毫升

80% 甘油 625微升

10% 過硫酸銨 （ammonium persulfate）           150微升

TEMED                                                                          10微升

（3） 按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。

4.EMSA結(jié)合反應(yīng)：

（1） 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：

陰性對(duì)照反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                                 7微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                            2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                                     0微升

標(biāo)記好的探針                                                                 1微升

總體積                                                                             10微升

樣品反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                                  5微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                             2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                                     2微升

標(biāo)記好的探針                                                                  1微升

總體積                                                                              10微升

探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                     4微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                        2微升

未標(biāo)記的探針                                                    1微升

標(biāo)記好的探針                                                    1微升

總體積                                                                10微升

突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                     4微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                        2微升

未標(biāo)記的突變探針                                            1微升

標(biāo)記好的探針                                                    1微升

總體積                                                                10微升

Super-shift反應(yīng)：

Nuclease-Free Water                                      4微升

EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）                 2微升

細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子                         2微升

目的蛋白特異抗體                                              1微升

標(biāo)記好的探針                                                      1微升

總體積                                                                  10微升

（2） 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫（20-25℃）放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫（20-25℃）放置20分鐘。

（3） 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無色，10X），混勻后立即上樣。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對(duì)于使用無色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。

5. 電泳分析：

（1） 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍(lán)色），以觀察電壓是否正常進(jìn)行。

（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 （藍(lán)色），用于觀察電泳進(jìn)行的情況。

（3） 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。

（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板），把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘），輕輕揭起濾紙，這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測(cè)，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè)。