聯(lián)系電話
上海北諾生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員·14年
- 聯(lián)系人：
- 周經(jīng)理 劉經(jīng)理
- 電話：
- 021-57730393
- 手機(jī)：
- 15800960770
- 傳真：
- 86-021-61496710
- 地址：
- 上海市徐匯區(qū)宜山路520號(hào)中華門大廈18樓D座
- 個(gè)性化：
- www.bnbiotech.com
- 網(wǎng)址：
- www.bnbiotech.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
zui近有一些戰(zhàn)友對(duì)熒光原位雜交技術(shù)比較感興趣，我整理了相關(guān)資料和自己的心得，和大家交流一下。不妥之處，請(qǐng)大家指出，共同討論學(xué)習(xí)。
內(nèi)容分三部分：
一、概述
1. 克隆性染色體異常是腫瘤的特征
2. 染色體異常常見的類型
3. 染色體異常的檢測(cè)方法
二、熒光原位雜交及其探針
1. 熒光原位雜交的原理
2. 熒光原位雜交的探針
三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交（按試驗(yàn)流程介紹）
一、 概述
1. 克隆性染色體異常是腫瘤的特征
1914年德國(guó)遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關(guān)，然而這還僅僅只是一個(gè)假說；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）的患者中發(fā)現(xiàn)后來被稱為費(fèi)城染色體（Philadelphia chromosome）的微小染色體；1973年Rowley證實(shí)了Ph染色體是9號(hào)和22號(hào)染色體易位所致，這是人們?cè)谀[瘤中認(rèn)識(shí)到的*個(gè)染色體易位；目前，已經(jīng)有11,500篇文獻(xiàn)報(bào)道了55,600多種克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常。這些染色體畸變，尤其是染色體易位及其相應(yīng)的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作用，無不說明克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常是腫瘤的特征，在腫瘤起源中起重要作用。
下圖是各種疾病報(bào)告的克隆性染色體異常病例數(shù)
下圖是染色體數(shù)目異常
染色體結(jié)構(gòu)異常
3. 染色體異常的檢測(cè)方法
下圖是各種疾病報(bào)告的克隆性染色體異常病例數(shù)
2. 染色體異常的常見類型
染色體異常指數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常兩類：前者包括整條染色體數(shù)目的擴(kuò)增和缺失；后者包括染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴(kuò)增等。
下圖是染色體數(shù)目異常
染色體結(jié)構(gòu)異常
3. 染色體異常的檢測(cè)方法
染色體異常的識(shí)別得益于二十世紀(jì)六十年代后發(fā)展起來的胰蛋白酶－姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù)，使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測(cè)染色體核型改變成為可能。染色體顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)和常用的方法，但耗時(shí)且依賴于獲得良好的分裂相，還難于分析復(fù)雜和隱匿的異常。
二、 熒光原位雜交及其探針
1. 熒光原位雜交的原理
染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開創(chuàng)了一門新的學(xué)科——分子細(xì)胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是Southern blot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標(biāo)記或以熒光素直接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標(biāo)記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點(diǎn)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還可以使用多種熒光標(biāo)記，顯示DNA段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位。
2. 熒光原位雜交探針的類型
FISH技術(shù)種類甚多，發(fā)展迅速，其實(shí)現(xiàn)需要獲得能與靶序列互補(bǔ)結(jié)合的探針。常用的探針有以下三類：
（1）染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒α-衛(wèi)星 DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目異常，同時(shí)由于G顯帶時(shí)，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測(cè)，而應(yīng)用端粒探針則彌補(bǔ)了G顯帶的不足；
（2）染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；
（3）染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC）、細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）、P1人工染色體（P1 artificial chromosome, PAC）探針，主要用以識(shí)別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。
（1）染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒α-衛(wèi)星 DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目異常，同時(shí)由于G顯帶時(shí)，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測(cè)，而應(yīng)用端粒探針則彌補(bǔ)了G顯帶的不足；
（2）染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；
（3）染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC）、細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome, BAC）、P1人工染色體（P1 artificial chromosome, PAC）探針，主要用以識(shí)別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。
α-衛(wèi)星DNA（alpha salite DNA）是*一個(gè)存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯(lián)重復(fù)片段，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長(zhǎng)達(dá)100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號(hào)。因此常被選為著絲粒探針的來源。
The Wellcome Trust Sanger Institute（Hinxton, Cambridge）由Wellcome Trust和British Medical Research Council聯(lián)合建立，是世界上較早開展人類基因組大規(guī)模測(cè)序并具有相當(dāng)實(shí)力的測(cè)序中心。該中心利用能容納大片段人類基因組DNA的高容量載體（如粘粒、BAC、PAC等）構(gòu)建了大片段人類基因組DNA文庫(kù)，通過文庫(kù)中末端相互重疊的DNA段連接成疊連群（contig）并與鳥槍法相結(jié)合，加快了基因組測(cè)序，實(shí)現(xiàn)了人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）中人類基因組的物理作圖（physical mapping）和基因組測(cè)序相結(jié)合的目標(biāo)。因此，這些克隆文庫(kù)為基因定位研究提供了豐富的DNA 序列資源，NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics提供的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)資源也記載了許多克隆基因組定位的詳細(xì)信息，為我們選擇相應(yīng)克隆為作為染色體單一序列和端粒探針的來源提供了便利。
大片段人類基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建過程
常用的BAC、PAC文庫(kù)
三、 熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交
實(shí)驗(yàn)流程
*天
缺口平移標(biāo)記探針
1.1 試劑準(zhǔn)備
（1） 0.1 mmol/L dNTP 0.3 mmol/L dATP、0.3 mmol/L dCTP和0.3 mmol/L dGTP等體積混合。
（2） 0.1mmol/L dTTP 1倍體積的0.3mmol/L dTTP和2倍體積的三蒸水混合。
1.2 缺口平移體系和反應(yīng)條件
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
0.1mmol/L dNTP 10μl
10× Nick Translation buffer 5μl
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl
Nick Translation Enzyme 10μl
DNA （1μg） X μl
H2O 18-X μl
in total 50μl
以上為標(biāo)記1μg DNA的缺口平移體系，若標(biāo)記更多量的DNA，則試劑量和反應(yīng)體系相應(yīng)等倍擴(kuò)大。各成分混勻后短時(shí)離心。對(duì)于≤10kb的質(zhì)粒，于15 ℃ 反應(yīng)3.5小時(shí)；對(duì)于BAC/PAC，于15 ℃ 反應(yīng)9小時(shí)。
1.3 凝膠電泳判斷探針大小
將EP管置于冰上，取其中5 μl 于70 ℃加熱5分鐘后行2 ％瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標(biāo)記探針的大小，單一序列探針合適大小為200～600 bp；如片段大小偏大，則于15℃延長(zhǎng)反應(yīng)10～30分鐘，再重復(fù)進(jìn)行凝膠電泳，直至得到合適大小的探針。
1.4 終止反應(yīng)
向反應(yīng)體系中加入1 μl 0.5 M EDTA和（或）70 ℃加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
1.2 DNA的沉淀
1.3 清洗沉淀
注：當(dāng)大部分乙醇蒸發(fā)時(shí)，白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡?；一定?清除乙醇，否則會(huì)在加入Master Mix后產(chǎn)生微小的沉淀，導(dǎo)致高背景。
1.4 溶解探針
2. 標(biāo)本（染色體靶DNA）的處理和變性
2.2 RNase A消化
2.3 靶DNA的變性
2.4 蛋白酶消化
3. 雜交
1.2 滴加一抗
1.3 滴加二抗
1.4 滴加三抗
2. 核復(fù)染和抗熒光淬滅劑封片
3. 熒光顯微鏡檢測(cè)FISH雜交信號(hào)
第二天
1. 探針的沉淀和變性
1.1 探針混合物的組成
（1） 對(duì)BAC/PAC探針
DNA探針 5ul
Human Cot-1 DNA 3ul
Salmon Sperm DNA 0.5ul
H2O 1.5ul
in total 10ul
（2） 對(duì)著絲粒探針：
DNA探針 5ul
Salmon Sperm DNA 0.5ul
H2O 4.5ul
in total 10ul
1.2 DNA的沉淀
將探針混合物與1ul（V/10）3M 醋酸鈉（PH5.2）和27.5ul（2.5V）無水乙醇（-20℃凍存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀），以14000g在4℃離心30min，以沉淀DNA。
1.3 清洗沉淀
小心棄去上清，用70 ％乙醇洗滌一次，再次以14000g在4℃離心15min；小心棄去上清，在45～50℃的中溫水浴中風(fēng)干DNA沉淀10～15min。
注：當(dāng)大部分乙醇蒸發(fā)時(shí)，白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡?；一定?清除乙醇，否則會(huì)在加入Master Mix后產(chǎn)生微小的沉淀，導(dǎo)致高背景。
1.4 溶解探針
加入5μl 預(yù)熱至37℃的去離子甲酰胺（PH 7.0），短時(shí)離心后在37 ℃振搖30 min以充分溶解DNA；再加入預(yù)熱至37 ℃的Master Mix 5μl，短時(shí)離心后在37 ℃振搖15～30 min。
注：振搖時(shí)間盡可能延長(zhǎng)；DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1 μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4 μl稀釋，混勻后瞬時(shí)離心，37 ℃振搖15～30 min。
1.5 探針的變性和預(yù)雜交
短時(shí)離心后于80 ℃水浴中變性探針10 min，冰浴5分鐘；短時(shí)離心，于37 ℃水浴中預(yù)雜交30～60 min；*序列探針（如cDNA）和重復(fù)序列探針（如α-衛(wèi)星DNA）探針，無需預(yù)雜交。
2. 標(biāo)本（染色體靶DNA）的處理和變性
2.1 滴片和老化
取出儲(chǔ)存于-20 ℃的細(xì)胞懸液標(biāo)本，以1100 rpm.離心10 min沉淀細(xì)胞，換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度，滴片，劃出雜交區(qū)域，晾干；在預(yù)熱到 37 ℃ 的2×SSC中老化30 min（也可實(shí)驗(yàn)前夜室溫老化再以2×SSC浸泡2分鐘）；依次于70 %、90 %和100 %的梯度乙醇中依次脫水，每缸2min，晾干（以下略作“梯度乙醇脫水后涼干”）。
2.2 RNase A消化
每張玻片上加30 μl 100 μg/ml RNA酶（將10mg/ml的RNase A儲(chǔ)存液稀釋100倍），蓋上22×22 mm蓋玻片，置于37℃濕盒中孵育1小時(shí)；室溫下2×SSC中振蕩洗滌，5min/次×3次；梯度乙醇脫水后涼干。
2.3 靶DNA的變性
將玻片放入預(yù)溫至72 ℃（每增加一張玻片，溫度要提高1℃）的70 %去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后，立即置入預(yù)冷至-20 ℃保存的梯度乙醇脫水晾干。
2.4 蛋白酶消化
將50 μl 100 mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為0.01 ％）加入預(yù)溫至37℃的50ml蒸餾水（PH 2.0，以適量稀鹽酸酸化）中，混勻；將變性后的玻片放入其中處理10分鐘；室溫下1×PBS中振蕩洗滌，5min/次×2次；室溫下梯度乙醇脫水后涼干。
注：靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同步進(jìn)行，完成后盡快進(jìn)行雜交。
3. 雜交
將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37 ℃雜交。
第三天
1. 雜交后洗滌和半抗原信號(hào)放大
1.1 雜交后洗片
小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預(yù)熱至46 ℃的50 ％甲酰胺/2×SSC中，5 min×3缸；將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5 min×2缸；每張玻片滴加30 μl阻斷液1，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37 ℃濕盒中孵育30 min；再次將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
注：此后步驟應(yīng)注意避光操作。
1.2 滴加一抗
將4 μl Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育1小時(shí)；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
1.3 滴加二抗
將4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl Biotinylated goat anti-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育40min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
1.4 滴加三抗
將4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區(qū)域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育30min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
注：以上步驟按雙色FISH描述，若為單色FISH則選擇相應(yīng)抗體即可。
2. 核復(fù)染和抗熒光淬滅劑封片
將1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中（終濃度為125 ng/ml，避光保存于4℃），混勻；將玻片置于其中，避光復(fù)染2min；2×SSC中洗滌5min；梯度乙醇脫水晾干；每張玻片滴加10 μl 抗熒光淬滅劑封片，蓋上22mm×22mm蓋玻片，-20 ℃避光保存。
3. 熒光顯微鏡檢測(cè)FISH雜交信號(hào)
以熒光顯微鏡觀察，在DAPI/FITC/Texas Red濾光鏡激發(fā)下觀察中期/間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)，計(jì)數(shù)細(xì)胞和采集圖像。每例分析100～200個(gè)間期細(xì)胞核細(xì)胞，重疊、破損、未去除細(xì)胞質(zhì)和雜交信號(hào)微弱的細(xì)胞核不計(jì)入其中。對(duì)于雙色雙融合FISH，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)相互靠近（<1/10核直徑的距離）者計(jì)為一個(gè)信號(hào)。
