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一、DNA的限制性酶切實(shí)驗(yàn)原理
核酸限制性?xún)?nèi)切酶 是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等功物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來(lái)ＤＮＡ的侵襲。
限制性?xún)?nèi)切酶 以?xún)?nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的ＤＮＡ段５’端為Ｐ，３’端為ＯＨ。
1. 限制性?xún)?nèi)切酶的類(lèi)型
根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類(lèi)。
*類(lèi)（I型）限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別專(zhuān)一的核苷酸 順序，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸 順序沒(méi)有專(zhuān)一性，是隨機(jī)的。這類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無(wú)法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類(lèi)酶如EcoB、EcoK等。
第三類(lèi)（III型）限制性?xún)?nèi)切酶也有專(zhuān)一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的。因此，這種限制性?xún)?nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA段，具有各種單鏈末端。因此也不能應(yīng)用于基因克隆。
第三類(lèi)（Ⅱ型）限制性?xún)?nèi)切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性?xún)?nèi)切酶.
它們能識(shí)別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ段；
Ⅱ型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識(shí)別順序一般為４～６個(gè)堿基對(duì)的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序；
Ⅱ型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口--５’端突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對(duì)遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進(jìn)行改造，從而極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。
粘性末端：是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱(chēng)為粘性末端。
如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?br />5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置切割后生成
5’……G AATTC……3’
3’……CTTAA G……5’
各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)DNA連接酶 的作用而“粘合”。
平頭末端：
II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRV 的識(shí)別位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’
3’…… CTA|TAG …… 5’
切割后形成
5’…… GAT ATC …… 3’
3’…… CTA TAG …… 5’
這種末端同樣可以通過(guò)DNA連接酶 連接起來(lái)。
2. 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法
用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱(chēng)，如E. coli 用Eco表示，所以用斜體字。
用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌（Heamophilus influenzae）Rd菌株用d，即Hind。
如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾酶，則以羅馬數(shù)字表示，如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
