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多藥抗藥基因的表達(dá)實驗
多藥抗藥基因的表達(dá)實驗是通過反轉(zhuǎn)錄和PCR的方法來檢測特定基因的過度表達(dá)。
實驗方法
- PCR擴(kuò)增法
| 實驗方法原理 | 大多MDR細(xì)胞膜上出現(xiàn)MDR-1基因及其基因產(chǎn)物P-糖蛋白過度表達(dá)。 |
|---|---|
| 實驗材料 | RNA |
| 試劑、試劑盒 | PBS 氯仿 異丙醇 萘酸 異硫氰酸肽 十二烷基肌酸鈉 構(gòu)櫞酸鈉 乙酸鈉 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶 |
| 儀器、耗材 | 離心機(jī) 紫外分光光度計 瓊脂糖凝膠電泳 PCR儀 |
| 實驗步驟 | 一、細(xì)胞總RNA提取
2. 取細(xì)胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系中，42℃保溫30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。 3. 然后置95℃，3 min 終止反轉(zhuǎn)錄。 4. 接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β2-MG引物，對cDNA上的目的片段進(jìn)行PCR 5. 94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)。 6. zui終在60℃保溫7 min，以保證產(chǎn)物充分延伸。 7. 取10 ul 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。 |
