一、原理

SNP （Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性（Polymorphism）。據(jù)估計，在人類基因組中，大約每千個堿基中有一個SNP，無論是比較于限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析還是微衛(wèi)星標(biāo)記（STR），都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的zui小單位,據(jù)估計，人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。一般認(rèn)為，相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點稱作單體型（haplotype）。大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個常見的單體型（每個具有至少5%的頻率），它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。一個染色體區(qū)域可以有很多SNP位點，但是我們一旦掌握了這個區(qū)域的單體型，就可以只使用少數(shù)幾個標(biāo)簽SNPs（tagSNP）來進(jìn)行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。

二、樣品準(zhǔn)備

1. DNA抽提

①    1、取新鮮肌肉組織約100mg，PBS漂洗干凈，置于1.5ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。

②    加200μl 緩沖液GA，震蕩至*懸浮。加入20μl 蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混勻

③    加220μl 緩沖液GB，充分混勻，37℃消化，溶液變清亮。加220μl 無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。

④    將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。

⑤    加入500μl 去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。

⑥    加入700μl 漂洗液GW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12000rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。

⑦    將吸附柱CB 轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，加入100μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應(yīng)在60-70℃水浴預(yù)熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。

⑧    采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度，在OD260 處有顯著吸收峰。同時檢測純度，OD260/280 的值應(yīng)為為1.7-1.9。

⑨    從原液中取出相應(yīng)體積DNA 溶液，稀釋致50ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。

2. PCR擴(kuò)增目的片段

按相關(guān)的試劑說明在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)管中準(zhǔn)備反應(yīng)體系，典型的PCR反應(yīng)體系如下（20ul體系）：

向左扳動儀器蓋子上的手柄，揭開儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應(yīng)樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。

3. 在T1型PCR儀上編輯一個程序

按[C programs]進(jìn)入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng)建一個程序請按[D enter]。要進(jìn)入一個子目錄，用→鍵將光標(biāo)向右移動，然后用↑↓鍵選擇一個子目錄。按[D enter]進(jìn)入選擇的子目錄。

輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認(rèn)溫度。為其輸入時間，用小數(shù)點來間隔。順序為h.m.s。用[D enter]確認(rèn)時間設(shè)置，或者用光標(biāo)鍵移動到下一個區(qū)域。＃表示循環(huán)的次數(shù)。設(shè)定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數(shù)為30時應(yīng)輸入“29”。用[C pgm ok]來儲存一個完整的程序。程序數(shù)據(jù)*的儲存在記憶中。

4. 運行程序

按[B start/stop]選擇一個程序。用→↑↓鍵選擇一個子目錄，或者用[D enter]進(jìn)入主目錄。輸入您想要啟動的程序的號碼?；蛘?，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個程序。用↑↓鍵在列表中滾動選擇。用[D enter]確認(rèn)用強(qiáng)光突出的程序。按[D start]啟動程序。

5. 控制測試過程

運行過程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時間信息。運行完成后，按STOP按鈕終止實驗，按YES確認(rèn)終止。小心旋開熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開蓋子，取出實驗樣品，再蓋上蓋子，關(guān)閉電源，本次實驗結(jié)束。

6. PCR產(chǎn)物測序

由專門負(fù)責(zé)測序的服務(wù)公司完成

7. 數(shù)據(jù)分析

少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發(fā)現(xiàn)的SNP在基因組中的位置：重點是啟動子區(qū)、外顯子區(qū)域（包括編碼區(qū)的cSNP及5’及3’UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導(dǎo)致氨基酸的改變：錯義突變、無義突變、終止突變。

8. 注意事項

①  為保證待測目的區(qū)域測序真實可靠，引物設(shè)計應(yīng)該使待測目的區(qū)域邊界距離上下游引物至少各50bp；

② 引物設(shè)計建議使用在線方式，以保證成功率；

③ 為保證測序敏感性，PCR產(chǎn)物片段大小應(yīng)在250bp－650bp范圍；

④ 為方便實驗，建議引物合成時分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測序的引物分開；

⑤ 為保證引物的特異性，建議引物設(shè)計后在NCBI上blast確認(rèn)；

⑥ 為防止降解，PCR產(chǎn)物應(yīng)盡快測序，否則應(yīng)該保存在-20℃，且時間不宜過長；

⑦ 為保證結(jié)果真實性，建議對關(guān)鍵點進(jìn)行反向測序確認(rèn)。