測(cè)定DNA 的核苷酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提。從小片段重疊法到加減法、雙脫氧鏈終止法、化學(xué)降解法、自動(dòng)測(cè)序，DNA 測(cè)序技術(shù)發(fā)展很快。目前在實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)序常用Sanger雙脫氧鏈終止法。Sanger法就是使用DNA 聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA 核苷酸序列的方法。它要求使用一種單鏈的DNA 模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA 模板和一種恰當(dāng)?shù)腄NA 合成引物。其基本原理是DNA 聚合酶利用單鏈的DNA 模板，合成出準(zhǔn)確互補(bǔ)鏈，在合成時(shí)，某種dNTP換成了ddNTP，這時(shí)，DNA 聚合酶利用2’，3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之摻入到寡核苷酸鏈的3’末端，導(dǎo)致3’末端無(wú)3'-OH，從而終止DNA 鏈的生長(zhǎng)，雙脫氧核苷酸的種類不同，摻入的位置不同就造成了在不同的專一位置終止的長(zhǎng)度不同的互補(bǔ)鏈。通過(guò)摻入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可讀出模板DNA 的互補(bǔ)鏈序列。

一、 試劑準(zhǔn)備

1. 硅化液：250ml，二氯二甲基硅烷25ml。

2.6%變性PAGE膠的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH₂O至500ml攪拌溶解，0.22μm濾膜過(guò)濾，4℃貯存于棕色瓶中。使用時(shí)取50ml加入催化劑過(guò)硫酸銨（25%）50μl，TEMED 50μl，輕搖混勻，立即灌膠。

3.質(zhì)粒DNA 堿變性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），無(wú)水乙醇，70%乙醇。

4.T7測(cè)序試劑盒。

二、操作步驟

1.  測(cè)序板硅化，流水、ddH₂O洗，無(wú)水乙醇洗，晾干。

2.  灌膠：裝好測(cè)序板，玻璃板以15-30°角度傾斜放置，用50ml注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間，將鯊魚(yú)齒梳子的平端插入膠的上緣，深約0.5-1cm。夾好，將測(cè)序板放水平。聚合約3hr后預(yù)電泳。

3.  預(yù)電泳：按照說(shuō)明要求安裝好電泳裝置，在上槽和下槽注入1×TBE。設(shè)置溫度50℃，功率100W，時(shí)間約30min。

（同時(shí)準(zhǔn)備測(cè)序反應(yīng)）

4.  質(zhì)粒DNA 雙鏈堿變性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH₂O中，加2N NaOH 8μl，混勻，室溫靜置15min。加3M NaAc 7μl，無(wú)水乙醇120μl，混勻，-20℃放置30min。離心12000g× 15min，棄上清，70%乙醇500μl洗一次，離心12000g×7min。棄上清，晾干沉淀，10μl滅菌ddH₂O溶解。

5.  模板與引物復(fù)性：加2μl測(cè)序引物、2μl Annealing buffer， 混勻，稍稍離心，65℃溫育 5min，立即放置于37℃10min，室溫5min以上。

6.  標(biāo)記反應(yīng)：加 3μl labeling mixture 、1μl相應(yīng)放射性同位素（10μCi）、2μl T7測(cè)序酶（使用前以稀釋液1∶5稀釋），混勻，離心，置37℃5min。

7.  預(yù)先準(zhǔn)備四個(gè)0.5ml微量離心管，標(biāo)上A、C、G、T，分別在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。

8.  鏈終止反應(yīng)：在A、C、G、T四個(gè)微量離心管中分別加入反應(yīng)液4.5μl，37℃ 5min。加入stop solution 5μl，短暫離心。

9.  上樣：關(guān)上預(yù)電泳電源，沖洗膠平面，將鯊魚(yú)齒插入膠平面中約1-2mm形成加樣孔。將四個(gè)反應(yīng)管置80℃ 2min。立即取1.5-2μl加到加樣孔上。

10．電泳: 50℃，100W，電泳2.5hr后，暫停電泳，在預(yù)留孔二次上樣后，繼續(xù)電泳2.5hr。

11．下膠：停止電泳，取下測(cè)序板，倒掉電泳緩沖液。拆開(kāi)測(cè)序板，凝膠應(yīng)粘在未硅化的的玻璃板上。裁一張比膠稍大一些的濾紙，平鋪在膠上，掀起濾紙，凝膠就被一起掀起。

12．壓片：將凝膠蓋上保鮮膜，用monitor測(cè)讀放射強(qiáng)度，以估計(jì)曝光時(shí)間。在暗室中覆上X光片，置暗夾中，-70℃放射自顯影。

13．洗片、讀片：取出暗夾，回到室溫。經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影，水洗，晾干。在X光片燈上讀出序列。

三、注意事項(xiàng)

1. 測(cè)序板清洗、硅化的好壞直接影響灌膠及下膠。處理不好時(shí)容易導(dǎo)致灌膠時(shí)氣泡的產(chǎn)生，下膠時(shí)則易使電泳膠損壞。

2. 灌膠時(shí)要避免膠的滲漏；注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間時(shí)，注意速度的控制，防止氣泡的產(chǎn)生。

3. 測(cè)序反應(yīng)及電泳上樣時(shí)要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同時(shí)要加強(qiáng)整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自身的防護(hù)。

4. 規(guī)范、妥善處理放射性同位素接觸物品及廢棄物。

手工測(cè)序需要使用同位素，這給操作帶來(lái)許多不便，對(duì)操作者也有一定的損害。DNA 測(cè)序儀的出現(xiàn)解決了這一問(wèn)題，它不使用同位素標(biāo)記，自動(dòng)化程度高，測(cè)序效果好。雖然DNA 測(cè)序儀的價(jià)格目前仍比較高，但每次測(cè)序的花費(fèi)并不算高，而且商品化服務(wù)也令人滿意。