磷酸鈣-DNA 共沉淀法

核酸以磷酸鈣-DNA 共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA 附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA 僅有1%～5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA 可以與細(xì)胞DNA 整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA 導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是zui常用并的方法。

1、配液

（1）2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na₂ PO4 、2H₂ O

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存

（2）2mmol/L CaCl₂ 過濾除菌

（3）TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

（4）G418（新霉素G418）液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H₂O至10mL過濾除菌4℃保存。

（5）G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200～800mg/L

注意：對受體細(xì)胞先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在10～14天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的zui低濃度。

2、操作步驟[方法一]：

（1）供體DNA 制備：方法按前介紹的DNA 提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

（2）受體細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動(dòng)物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種密度為2×104 /cm² ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO₂ 培養(yǎng)，待細(xì)胞占50～70%瓶底面積時(shí)，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

（3）DNA -磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細(xì)胞DNA 和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA 用TE配制成40mg/L的DNA 溶液，同時(shí)向供體細(xì)胞DNA 液200μl中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA 液（20mg/L）220μl和2×HBS 250μl（PSV2-neo為1～2mg/L的使用量）。

②取500μl上述DNA 溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl₂ 混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。

（4）轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞

①將處于對數(shù)生長期已占瓶底50～70%的受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。

②吸取0.5ml DNA -磷酸鈣沉淀，加入含5ml培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO₂ 培養(yǎng)24h或更長，使細(xì)胞充分吸入DNA -磷酸鈣結(jié)晶顆粒。

④更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞。

⑥培養(yǎng)大約3～5天，對照細(xì)胞大部分死亡，這時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每3～4天更換一次選擇培養(yǎng)基。

⑦2周后對照細(xì)胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆 出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，并做進(jìn)一步鑒定。

本實(shí)驗(yàn)要加入PSV2-neo、DNA 與外源DNA 共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，這樣可使受體細(xì)胞獲得新霉素（neo）基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞建立細(xì)胞株。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA 只需將從癌細(xì)胞中提取的DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞即可，其方法如下：

3、DNA 轉(zhuǎn)染[方法二]：

（1）配制磷酸轉(zhuǎn)染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時(shí)現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na₂HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?/p>

加溫水至 1000ml

（2）按前面介紹的方法提取癌細(xì)胞DNA 。

（3）取供體DNA 50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。

（4）再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。

（5）加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA 充分溶解后，再加入2.5MCaCl₂ ,含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次（不用攪拌器以防DNA 袢結(jié)），置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時(shí)，即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

（6）取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生長期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)，更換培養(yǎng)液（5ml/瓶）1次。

（7）轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA -磷酸鈣沉淀物0.5～1ml/瓶，置37℃作用4～6小時(shí)。

（8）培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時(shí)血清用量降至5%，培養(yǎng)2～3周。

（9）檢測：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后，分離，擴(kuò)大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。

脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA 轉(zhuǎn)染法

脂質(zhì)體（lipofectin regeant,LR）試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1（w/w）]。它適用于把DNA 轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA 和RNA 轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。

用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對每批LR都要做：*，先要固定一個(gè)DNA 的量和DNA /LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA 可從1～5μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA 兩者*的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間（2～24小時(shí)）。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜。

細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

1、操作步驟[方法一]：

（1）：取6孔培養(yǎng)板（或用35mm培養(yǎng)皿），向每孔中加入2ml含1～2×10⁵ 個(gè)液，37℃CO₂ 培養(yǎng)至40%～60%匯合時(shí)（匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞）。

（2）轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量）A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg DNA ，終量100μl，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μl,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染（如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA 濃度過高所致，應(yīng)酌情減量）。

（3）轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2ml不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1ml不含血清培養(yǎng)液。

（4）轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

（5）其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：

（1）以5×10⁵ 細(xì)胞/孔接種6孔板（或35mm培養(yǎng)皿）培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到50～60%板底面積。

（2）在試管中配制DNA /脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在1ml無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA 或供體DNA 。

②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上。

（3）棄去細(xì)胞中的舊液，用1ml無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1ml DNA /脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3～5小時(shí)。

（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14～24小時(shí)，

（5）吸出DMEM/DNA /脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2ml/孔，再培養(yǎng)24～48小時(shí)。

（6）用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

（1）接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

（2）DNA /脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前（2）、（3）步驟。

（3）在每孔中加入1ml、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。

（4）吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆 ，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。

DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法

DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA /DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖（1g/L）作用較短時(shí)間（30分鐘-1.5小時(shí)），又可用較低濃度（250g/L）的DEAE-葡聚糖作用較長時(shí)間（8小時(shí)）。

方法如下：

（1）接種鼠L成纖維細(xì)胞濃度為5×10⁵ CO₂ /孔/皿生長2～3天，當(dāng)達(dá)50%板底面積可用。

（2）乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質(zhì)粒DNA ，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA 。

（3）用10ml 1×PBS、4ml、10%富合生長因子血清的DMEM洗板（皿）。

（4）在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA ，取120μl DNA /DEAE-葡聚糖加到每孔（皿）細(xì)胞中，使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時(shí)。

（5）從孔（皿）中吸出DNA /DEAE-葡聚糖，加入5ml 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5ml 1×PBS洗一次吸出，加入10ml培養(yǎng)液（10%血清的DMEM）。

（6）培養(yǎng)細(xì)胞，在適當(dāng)時(shí)間分析細(xì)胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，方法同前。

*，科研工作者在進(jìn)行醫(yī)藥方面的科學(xué)研究之前，需要制定完善的統(tǒng)計(jì)研究設(shè)計(jì)方案，那么什么樣的設(shè)計(jì)方案才稱得上是完善的呢？ 一般來說，完善的設(shè)計(jì)方案需具備以下幾個(gè)條件：實(shí)驗(yàn)所需的人力、物力和時(shí)間資源；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的“三要素”和“六原則”均符合專業(yè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集、整理、分析等有一套規(guī)范的規(guī)定和正確的方法。而其中準(zhǔn)確把握統(tǒng)計(jì)研究設(shè)計(jì)的“三要素和六原則”，是科學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的核心。