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標(biāo)簽： T4 DNA 聚合酶
T4 DNA 聚合酶具依賴人為模板的聚合酶活性，同時(shí)具有對(duì)單鏈、雙鏈DNA的3’到5’端的外切酶活性，缺少5’到3’端的外切酶活性。
實(shí)驗(yàn)方法
- T4 DNA聚合酶
| 實(shí)驗(yàn)材料 | DNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT |
| 儀器、耗材 | 水浴鍋 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、50 μl 反應(yīng)體積：
二、dNTp濃度的效應(yīng)
1. 高濃度的dNTP在通常實(shí)驗(yàn)下可以增加聚合酶活性對(duì)外切酶活性的比值。
三、度的效應(yīng)
用T4 DNA聚合酶標(biāo)記3’末端時(shí)，反應(yīng)溫度保持在11℃，在較髙溫度下，其外切酶活性易降解DNA模板。 收起 |
| 其他 | 一、緩沖系統(tǒng)的相容性
許多限制性內(nèi)切酶能在T4 DNA聚合酶的緩沖系統(tǒng)進(jìn)行切割反應(yīng)，同時(shí)，T4 DNA 聚合酶也能直接使用。 二、應(yīng)用
1. 放射性標(biāo)記DNA段的3’末端，含5’凸出端的DNA段及濃度為1~2 μmol/l 的適當(dāng)［α-32P］dNTP，在11℃溫育20 min。
2. 選擇性及無選擇標(biāo)記線性化雙鏈DNA分子的3’宋端，即所謂的“置換合成”。雙鏈 DNA段在dNTP存在下與T4 聚合酶溫育，其3’末瑞的外切酶活性導(dǎo)致從 3’末端降解DNA，當(dāng)補(bǔ)加4種dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA鏌板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板時(shí)加入4種dNTP混合液，可獲得zui隹標(biāo)記效果。 |
