考馬氏亮藍(lán)G－250染色法使用方法

【操作步驟】
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
按下表操作，在試管中分別加入0、20、40、80、100微克蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到100微升，加入3ml的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。

編　　　號(hào)	1	2	3	4	5	6
蛋白標(biāo)準(zhǔn)（ml）	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.10
蒸餾水（ml）	0.10	0.08	0.06	0.04	0.02	0
染色液（ml）	3	3	3	3	3	3

在595nm波長比色，讀出吸光度，以各管的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、血清蛋白質(zhì)測定
稀釋血清（或其它蛋白樣品溶液），準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作?；靹蚝笫覝胤胖?5分鐘，在595nm波長比色，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

 

試劑（毫升）	1（空白管）	2（標(biāo)準(zhǔn)管）	3（樣品管）
蒸　餾　水	0.1	—	—
蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)	—	0.1	—
稀釋血清	—	—	0.1
染　色　液	3	3	3

【原 理】
考馬氏亮藍(lán)G－250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，zui大吸收波長從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
【注意事項(xiàng)】
1、常用試劑的干擾：有些常用試劑在測定中會(huì)受到不同程度的干擾。Tris、巰基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢劑有較少影響，而1％SDS、1％ TritonX-100及1％Hemosol的干擾嚴(yán)重。
2、顯色結(jié)果受時(shí)間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的測定控制在同一條件下進(jìn)行。
3、考馬氏亮藍(lán)G－250染色能力很強(qiáng)，特別要注意比色杯的清洗。顏色的吸附對本次測定影響很大?？蓪y量杯在0.1mol/L HCl中浸泡數(shù)小時(shí)，再?zèng)_洗干凈即可。

【試 劑】
1、考馬氏亮藍(lán)G－250染色液：
稱取100mg考馬氏亮藍(lán)G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀釋到1升。
2、蛋白標(biāo)準(zhǔn)（0.1mg/ml）
準(zhǔn)確稱取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度，溶后分裝，－20℃冰箱保存。
【計(jì) 算】
每100毫升血清中蛋白質(zhì)的含量（g％）

此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配制極簡單，重復(fù)性好，但干擾因素多。