操作elisa的方法與注意事項(xiàng)

       似乎很多做elisa實(shí)驗(yàn)的人都非常關(guān)注它的操作方法，其次就是它的原理啊概念啊什么的，其實(shí)還需要較為關(guān)注的就是操作的同時(shí)有哪些注意事項(xiàng)，關(guān)于elisa的各個(gè)方面有很多，今天，上海滬鼎生物的技術(shù)部工作人員來(lái)為大家分享一下 elisa的操作方法與它的注意事項(xiàng)。

       今天我們重點(diǎn)說(shuō)的是elisa的操作方法與注意事項(xiàng)，但是我們也先來(lái)看一看它的原理，elisa是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。

       然而由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。比較常用的是elisa雙抗體夾心法及elisa接法。

       說(shuō)完elisa的原理，我們?cè)賮?lái)說(shuō)說(shuō)操作elisa的幾種方法，方法一就是用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法，1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　結(jié)果判定為：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
　　方法二就是用于檢測(cè)未知抗體的間接法，用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照）于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

       以上就是elisa的操作方法，注意事項(xiàng)有兩點(diǎn)。*點(diǎn)是在正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說(shuō)明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
　  還有一點(diǎn)就是在elisa中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括了四小點(diǎn)，

（1）.固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1～10μg／ml。

（3）　酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定（見(jiàn)酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。

（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無(wú)色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

       其實(shí)我們?cè)谝陨险f(shuō)了三塊內(nèi)容，elisa的操作方法，還有注意事項(xiàng)，其中還包括了原理，關(guān)于elisa的方方面面有很多，在這里我們今天呢就說(shuō)這些，想了解更多資料，歡迎關(guān)注上海滬鼎生物。我司國(guó)慶期間有優(yōu)惠*打折活動(dòng)，而且有買(mǎi)就有送，我們忠誠(chéng)的期待您的來(lái)電，上海滬鼎生物恭祝朋友們生活愉快！

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                                                                                                                       2013-9-29