酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法是ELISA方法中的一種，目前國內(nèi)很少客戶用這種方法檢測(cè)，一般都是用的雙抗體夾心法及間接法，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法國內(nèi)很少客戶用這種方法檢測(cè)，但是我們也該清楚他們的操作步驟，下面讓我們一起來看看我司錢為客戶準(zhǔn)備的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法操作步驟：

1.用100ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育10分鐘。
2.倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合，每孔加100ul，蓋上板蓋。
4. 倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS(見試劑準(zhǔn)備)，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時(shí)。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液(含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑)。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激(間接Eli-spot)。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的 96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時(shí)間(15-20小時(shí))。這期間不要晃動(dòng)或移動(dòng)孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測(cè)抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，37℃下孵育1小時(shí)30 分。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，37℃孵育1小時(shí)。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。*顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時(shí)，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一 夜，點(diǎn)會(huì)比較明顯。此板在室溫下避光保存。