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豚鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α） ELISA檢測(cè)試劑盒配制
閱讀：613 發(fā)布時(shí)間：2013-4-22| 提 供 商 | 上海滬鼎生物科技有限公司 | 資料大小 | 6KB |
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試驗(yàn)原理：
TNF-Α試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知TNF-Α濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品 加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將TNF-Α和生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-Α的濃度呈比例關(guān)系。
試劑盒內(nèi)容及其配制：
| 試劑盒成份 | 96孔配置 | 48孔配置 |
| 96/48人份酶標(biāo)板 | 1塊板（96T） | 半塊板（48T） |
| 塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品：600pg/ml | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） |
| 空白對(duì)照 | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） |
| 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） |
| 生物素標(biāo)記的抗TNF-Α抗體 | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） |
| 親和鏈酶素-HRP | 1瓶（12ml） | 1瓶（5ml） |
| 洗滌緩沖液 | 1瓶（20ml） | 1瓶（10ml） |
| 底物A | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） |
| 底物B | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） |
| 終止液 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） |
自備材料：
1. 蒸餾水。
2. 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。
4.
樣品收集、處理及保存方法：
1、 血清……操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原
和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅
細(xì)胞迅速小心地分離。
2、 血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測(cè)。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細(xì)胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。
5、 保存……如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
操作注意事項(xiàng)：
● 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
● 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
● 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
● 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
● 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
● 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長(zhǎng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
● 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
● 按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
安全性：
1. 避免直接接觸終止液和底物A、B，一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。
2. 實(shí)難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
試劑的準(zhǔn)備：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋?xiě)?yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
| 600 pg/ml | （6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul |
| 300 pg/ml | （5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 150 pg/ml | （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 75 pg/ml | （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 37.5 pg/ml | （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 18.7 pg/ml | （1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
| 0 pg/ml | （空白對(duì)照） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul |
2. 洗滌緩沖液（50×）的稀釋?zhuān)赫麴s水50倍稀釋。
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui小的檢測(cè)濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
操作步驟：
1. 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2. 根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。
4. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。
8. 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。
9. 在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié) 果 判 斷 與 分 析：
1、 儀器值：于波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、 以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的TNF-Α標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的TNF-Α含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
3、 檢測(cè)值范圍： 0-600pg/ml
4、 敏感度:1.0pg/ml