HL10152.3
細(xì)菌胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
主要用途
細(xì)菌胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑是一種旨在通過胞漿鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與
鈣離子結(jié)合后，其熒光強度顯著增強，在熒光酶標(biāo)儀下測量不同激發(fā)波長下相對熒光峰值的比值，來測定
細(xì)菌胞漿總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種
活體細(xì)菌胞漿鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。
技術(shù)背景
細(xì)胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。在細(xì)菌中，鈣對于細(xì)菌
的生長和結(jié)構(gòu)具有重要作用。細(xì)胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame
photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器
的特殊的要求，以及需要細(xì)胞漿分離。Fura-2 AM（acetoxy-methyl ester），一種具有細(xì)胞膜通透性，與鈣離
子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料，通過其不同激發(fā)波長340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號比（散發(fā)波長505nm）來測
定細(xì)菌胞漿內(nèi)鈣離子水平。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 40 毫升
染色液（Reagent B） 30 微升
介導(dǎo)液（Reagent C） 600 微升
飽和液（Reagent D） 2 毫升
陰性液（Reagent E） 2 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；
有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品操作的容器
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
100 微升1 厘米光徑比色皿或黑色96 孔板：用于熒光分析的容器
熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察
實驗步驟
2
一、樣品準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好1 毫升待測的細(xì)菌樣品（1 X 108 細(xì)菌/毫升0
2． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為3500g
3． 小心抽去上清液
4． 加入1 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)菌顆粒群
5． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為3500g
6． 小心抽去上清液
7． 重復(fù)實驗步驟4 至6 一次
8． 加入1 毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)菌顆粒群
9． 放進(jìn)冰槽里備用
二、測定準(zhǔn)備
1． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀：激發(fā)波長340nm 和380nm，散發(fā)波長505nm
2． 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30 微升
介導(dǎo)液（Reagent C）和1.5 微升染色液（Reagent B）到新的1.5 毫升離心管，標(biāo)記為染色工作液，并
放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。
二、熒光酶標(biāo)儀檢測
1． 準(zhǔn)備3 個1.5 毫升離心管，標(biāo)記為：細(xì)菌樣品管、空白對照管（不含細(xì)菌）、大對照管（含細(xì)菌）
2． 分別移取100 微升上述準(zhǔn)備的細(xì)菌樣品到細(xì)菌樣品管和大樣品管里
3． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為3500g
3． 小心抽去上清液
4． 加入100 微升清理液（Reagent A）到細(xì)菌樣品管里，混勻細(xì)菌顆粒群
5． 加入100 微升飽和液（Reagent D）到大對照管里，混勻細(xì)菌顆粒群
6． 加入100 微升陰性液（Reagent E）到空白對照管里
7． 分別加入10 微升染色工作液到所有管里，混勻
8． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育120 分鐘，避免光照
9． 轉(zhuǎn)移到100 微升1 厘米光徑比色皿或黑色96 孔板里
10．即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU340nm、
樣品RFU380nm、空白對照孔RFU340nm、空白對照孔RFU380nm、大對照孔RFU340nm、大對照孔
RFU380nm
11．計算樣品細(xì)菌胞漿鈣離子濃度
{[(樣品RFU 340mm/樣品RFU380nm）-（空白對照孔RFU340nm/空白對照孔RFU380nm）】÷【（大對
照孔RFU 340nm/大對照孔RFU380nm-樣品RFU 340nm/樣品RFU 380nm）】X（空白對照RFU380nm/
大對照孔RFU380nm）X315（納摩爾：解離常數(shù)）
三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測
1． 移取300 微升上述準(zhǔn)備的細(xì)菌樣品到1.5 毫升離心管
2． 加入30 微升染色工作液，混勻
3． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育120 分鐘，避免光照
3
4． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為3500g
4． 小心抽去上清液
5． 小心加入500 微升清理液（Reagent A），混勻細(xì)菌顆粒群
5． 放進(jìn)微型臺式離心機離心5 分鐘，速度為3500g
6． 小心抽去上清液
7． 小心加入300 微升清理液（Reagent A），混勻細(xì)菌顆粒群
8． 移取50 微升到載玻片上
9． 蓋上蓋玻片
10．即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長340 至400nm，散發(fā)波長505nm（細(xì)菌胞漿鈣離
子呈現(xiàn)藍(lán)色熒光）
注意事項
1． 本產(chǎn)品為20 次（顯微鏡）或60 次（96 孔板）操作
2． 操作時，須戴手套
3． 可以使用熒光分光光度儀檢測
4． 避免使用EDTA 等處理樣品
5． 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定
6． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
7． 檢測敏感度可達(dá)納摩爾級鈣濃度范圍
8． 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感