— — 生物化學(xué)發(fā)光檢測法（熒光素酶） 

活體成像技術(shù)（optical in vivo imaging）目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)，生物發(fā)光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學(xué)發(fā)光的原理，將體外能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株植入動物體內(nèi)，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應(yīng)，利用光學(xué)系統(tǒng)檢測光強(qiáng)度，間接反映出細(xì)胞數(shù)量的變化或細(xì)胞的定位。這項技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，有腫瘤或疾病動物模型的建立，并可用于病毒學(xué)研究、siRNA研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究等。

常見的熒光素酶有兩種，分別是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，編碼基因是luc）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，編碼基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下，底物被氧化發(fā)光（不同底物光的顏色和波長不同），當(dāng)?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性。 

D-Luciferin：有三種，分別是D-Luciferin, Sodium Salt/D熒光素鈉鹽、D-Luciferin, Potassium Salt/D-熒光素鉀鹽和D-Luciferin Firefly,free acid/D-螢火蟲熒光素YEASEN公司提供幾種常用類型的D-Luciferin，每批試劑都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量驗證（經(jīng)9次獨立的HPLC和FTIR標(biāo)準(zhǔn)法監(jiān)測）和發(fā)光效率檢測，確?？蛻裘看卧囼灥母咧貜?fù)性和成功性。所有產(chǎn)品都可用于體內(nèi)成像分析和體外化學(xué)發(fā)光檢測實驗。YEASEN的D-Luciferin是合成的螢火蟲熒光素，結(jié)構(gòu)與promega公司提供的甲蟲熒光素一致，是水溶性的螢火蟲熒光素酶底物。

（1）D-Luciferin, Sodium Salt/D熒光素鈉鹽

分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 純度：高級純（99.7%）
應(yīng) 用：1）體外化學(xué)發(fā)光分析（in vitro）；2）活體成像實驗（in vivo）；3）高靈敏度ATP分析；
步 驟：
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測
1）用33.3 mL蒸餾水溶解1.0 gD-熒光素鈉鹽，配制成100 mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2）用組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液，配置工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
4）待圖像分析前，向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析。
Protocol 2：In vivo analysis / 活體成像分析
1）用無菌的PBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-熒光素鈉鹽工作液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）注射量取決于注射方式，具體如下：

3）注射入體內(nèi)5-10分鐘后，進(jìn)行成像分析。

（2）D-Luciferin, Potassium Salt/D-熒光素鉀鹽

分子式：NaC11H7N2O3S2·H2O 分子量：320.32 g/mol 純度：高級純（99.7%）
應(yīng)用：
1）活細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)luc標(biāo)記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達(dá)的成像分析；
2）廣泛用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析；
Protocol 1：In Vitro Bioluminescent Assays/ 體外生物發(fā)光檢測
1）配制成100 mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml）?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。
2）用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液，配制工作液(終濃度150μg/mL)。
3）去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基直至無殘留。
4）圖像分析前立即向細(xì)胞內(nèi)添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析（或者細(xì)胞放在37℃短時間孵育后檢測可增強(qiáng)信號）。
Protocol 2：In vivo analysis in mice / 小鼠活體成像分析
1）用無菌的DPBS（w/o Mg2+、Ca2+）配制D-熒光素鉀鹽溶液(15mg/mL)，0.2um濾膜過濾除菌。一旦使用，保持冰冷且避光。
2）按10 μL/g體重的濃度向每支小鼠注射相應(yīng)量的15mg/mL熒光素溶液；
3）腹腔注射10-15 min后進(jìn)行成像分析。（對每只動物模型做熒光素動力學(xué)研究以確定峰值信號獲取時間）

（3）D-Luciferin Firefly,free acid/D-螢火蟲熒光素

分子式：C11H8N2O3S2 分子量：280.330 g/mol 外觀：白色至淺黃色粉末
溶解：0.25%濃度溶解于甲醇，形成近乎無色至淺黃色的清夜
保存：-15°C 避光
應(yīng)用：
1）活細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)luc標(biāo)記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達(dá)的成像分析；
2）廣泛用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析；

應(yīng)用實例：

活體成像檢測CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 T細(xì)胞對小鼠皮下注射HN4細(xì)胞成瘤的治療作用（Mei Z et al. Cancer Med. 2020 ）

使用熒光素（Luciferin）發(fā)表的文獻(xiàn):

[1] Chen G, Fan XY, Zheng XP, Jin YL, Liu Y, Liu SC. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells ameliorate insulin resistance via PTEN-mediated crosstalk between the PI3K/Akt and Erk/MAPKs signaling pathways in the skeletal muscles of db/db mice. Stem Cell Res Ther. 2020 Sep 16;11(1):401. doi: 10.1186/s13287-020-01865-7. PMID: 32938466; PMCID: PMC7493876.

[2] Tang Y, Lin S, Yin S, Jiang F, Zhou M, Yang G, Sun N, Zhang W, Jiang X. In situ gas foaming based on magnesium particle degradation: A novel approach to fabricate injectable macroporous hydrogels. Biomaterials. 2020 Feb;232:119727. doi: 10.1016/j.biomaterials.2019.119727. Epub 2019 Dec 24. PMID: 31918223.

[3] Xuan Z, Zhao L, Li Z, Song W, Chen J, Chen J, Chen H, Song G, Jin C, Zhou M, Xie H, Zheng S, Song P. EPS8L3 promotes hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis by modulating EGFR dimerization and internalization. Am J Cancer Res. 2020 Jan 1;10(1):60-77. PMID: 32064153; PMCID: PMC7017737.

[4] Zhou Y , Zhou C , Zou Y , Jin Y , Han S , Liu Q , Hu X , Wang L , Ma Y , Liu Y . Multi pH-sensitive polymer-drug conjugate mixed micelles for efficient co-delivery of doxorubicin and curcumin to synergistically suppress tumor metastasis. Biomater Sci. 2020 Sep 21;8(18):5029-5046. doi: 10.1039/d0bm00840k. Epub 2020 Aug 19. PMID: 32812957.

[5] Ni XR, Zhao YY, Cai HP, Yu ZH, Wang J, Chen FR, Yu YJ, Feng GK, Chen ZP. Transferrin receptor 1 targeted optical imaging for identifying glioma margin in mouse models. J Neurooncol. 2020 Jun;148(2):245-258. doi: 10.1007/s11060-020-03527-3. Epub 2020 May 13. PMID: 32405996.

[6] Wu D, Lv J, Zhao R, Wu Z, Zheng D, Shi J, Lin S, Wang S, Wu Q, Long Y, Li P, Yao Y. PSCA is a target of chimeric antigen receptor T cells in gastric cancer. Biomark Res. 2020 Jan 28;8:3. doi: 10.1186/s40364-020-0183-x. PMID: 32010446; PMCID: PMC6988264.

[7] Mei Z, Zhang K, Lam AK, Huang J, Qiu F, Qiao B, Zhang Y. MUC1 as a target for CAR-T therapy in head and neck squamous cell carinoma. Cancer Med. 2020 Jan;9(2):640-652. doi: 10.1002/cam4.2733. Epub 2019 Dec 4. PMID: 31800160; PMCID: PMC6970025.

[8] Hu H, Zhang Z, Wang R, Wang Y, Jin J, Cai L, Yang J, Duan H, Wu Z, Fang Z, Liu B. BGC823 Cell Line with the Stable Expression of iRFP720 Retains Its Primary Properties with Promising Fluorescence Imaging Ability. DNA Cell Biol. 2020 May;39(5):900-908. doi: 10.1089/dna.2019.5057. Epub 2020 Feb 25. PMID: 32096664.

[9] Qiu J , Peng P , Xin M , Wen Z , Chen Z , Lin S , Kuang M , Fu Y , Fang G , Li S , Li C , Mao J , Qin L , Ding Y . ZBTB20-mediated titanium particle-induced peri-implant osteolysis by promoting macrophage inflammatory responses. Biomater Sci. 2020 Jun 7;8(11):3147-3163. doi: 10.1039/d0bm00147c. Epub 2020 May 4. PMID: 32363359.

[10] Zhao XY, Jiang Q, Jiang H, Hu LJ, Zhao T, Yu XX, Huang XJ. Expanded clinical-grade membrane-bound IL-21/4-1BBL NK cell products exhibit activity against acute myeloid leukemia in vivo. Eur J Immunol. 2020 Sep;50(9):1374-1385. doi: 10.1002/eji.201948375. Epub 2020 Jun 3. PMID: 32357256.

產(chǎn)品訂購

YEASEN提供三種coelenterazine類似物，分別是Coelenterazine，Coelenterazineh，Coelenterazine 400a。雖然三種都可用于相同實驗，但是得到的結(jié)果有差異。
Coelenterazine：普遍認(rèn)為是天然的腔腸熒光素，是海腎熒光素酶（Rluc）的作用底物，具有許多用途?？捎糜跈z測活細(xì)胞中鈣離子濃度，基因報告分析，BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）研究，ELISA，HTS，組織或細(xì)胞中超氧陰離子和過亞硝酸鹽的化學(xué)發(fā)光檢測。
Coelenterazine h:與Renilla熒光素酶或Gaussia熒光素酶使用具有一定的局限性。體外研究中比其他類似物更適合與鈣離子激活發(fā)光蛋白共用。據(jù)報道，Coelenterazine h的發(fā)光強(qiáng)度高于天然腔腸熒光素10-20倍，因此是用來檢測鈣離子濃度微小變化的有力工具。
Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的底物，此腔腸素衍生物在390 nm和400nm之間發(fā)藍(lán)色光，對GFP acceptor的光發(fā)射干擾最小。

（1）Coelenterazine（天然腔腸熒光素）

分子式：C26H21N3O3 分子量: 423.48 g/mol 純度：95% 保存：-15°C避光，保存在惰性氣體下
Protocol：發(fā)光檢測實驗
1）使用管光度計室溫下定量檢測發(fā)光情況，每個樣品做三個平行；
2）加入底物10s內(nèi)立即檢測，“integration time"為1 s；
3）對于細(xì)菌表達(dá)Gluc系統(tǒng)，甲醇溶解底物腔腸素制備10 mM儲存液，終濃度為10μmol/L。儲存液-20 °C保存，工作液制備過程需避光并置于冰上。 

（2）Coelenterazine 400 a/腔腸素400a

分子式：C26H21N3O 分子量：: 391.48 g/mol 純度：95%
儲存液制備：
1）開封前將瓶子放到室溫溫育，以避免產(chǎn)品發(fā)生任何的冷凝；
2）用125 μL無水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a，最終濃度是0.4μg/μL. ，輕輕混勻；（注：避免用DMSO或其他溶劑來溶解腔腸素400a，因為試劑可能被氧化）
3）分裝后避光保存在-20°C，保持干燥； 

（3）Coelenterazine h/ 腔腸素h（from Caliper LifeScience Inc.）

RediJectCoelenterazineh為即用的注射型生物發(fā)光底物，特別設(shè)計用于體內(nèi)成像研究。通過最小化產(chǎn)品成分的變化，最小化凍融次數(shù)和嚴(yán)格控制不同批次的產(chǎn)品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能確?？蛻舻玫礁咧貜?fù)性的結(jié)果。
優(yōu) 點：
◆預(yù)制配方，不同批次間嚴(yán)格控制特別設(shè)計用于體內(nèi)研究；
◆即用型產(chǎn)品通過最小化預(yù)成像準(zhǔn)備步驟，減少時間和精力；
◆每瓶可用于5只動物的成像研究；（10 瓶/kit）
◆經(jīng)IVIS成像系統(tǒng)驗證，控制體內(nèi)成像質(zhì)量；
顏色：黃色溶液（溶于丙二醇/檸檬酸鹽）
濃度：150 μg/mL （10瓶無菌溶液，每瓶含1.2 mL濃度為150 μg/mL的Coelenterazine h ）
保存： Store at ≤ -70 °C。
使用及注射劑量：
開始實驗前，37 °C水浴鍋解凍，避免重復(fù)凍融。靜脈注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1.   靜脈注射：推薦使用劑量15 μg/mouse(100 μL/mouse），用1 ml注射器直接從瓶內(nèi)吸取溶液，然后用25 gauge或更高的針頭注射入小鼠體內(nèi)。盡快成像檢測以獲得峰值信號。

2.   腹腔注射：推薦劑量是30 μg/mouse (200 μL/mouse)，方法同上。

應(yīng)用實例：

Figure 1. RedijectCoelenterazine has been optimized for in vivo use with IVISimaging systems. (A) 5 pmol BRET Qdot 700* were injected intravenouslyin a nu/nu mouse. 10 minutes post BRET Qdot injection 15 μg/mouseCoelenterazine h was injected intravenously. Chart shows peak signal wasobserved right after injection at ~ 22 seconds followed by rapidclearance. Images were taken with IVIS kinectic. (B) 1,2 and 4 pmol BRETQdot 655 were injected subcutaneously in a nu/nu mouse. 10 minutes postBRET Qdot injection 10 μg/mouse Coelenterazine was injectedintraperitoneally. Chart shows that peak signal was reached around 27minutes post i.p. injection of Coelenterazine.

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