TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)細胞凋亡檢測試劑盒（FITC）可以用來檢測組織細胞在凋亡晚期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因組DNA斷裂時暴露出的3′-羥基（3′-OH）末端摻入FITC-12-dUTP，從而可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

本試劑盒對標記反應進行了優(yōu)化，采用*比例的FITC-12-dUTP和未標記dNTP進行3’-OH末端的核苷酸摻入，使得同一個斷裂的DNA片段末端可以形成更長的“標記尾巴"。該“標記尾巴"減少了相鄰摻入dNTP上標記基團的空間位阻，增加每個斷裂片段上的熒光基團數(shù)目，降低熒光基團相鄰后可能造成的聚集和淬滅，從而提高檢測靈敏度，減少非特異性反應。

本試劑盒應用范圍廣，可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。

產(chǎn)品組分

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。

本試劑盒儲存在-20℃，F(xiàn)ITC-12-dUTP Labling Mix避光儲存于-20℃，保質期為一年。

注意事項

1）需自備用于洗滌細胞的PBS，用于封片的抗熒光淬滅封片液，用于固定的4%多聚甲醛。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

一、樣品準備

A. 石蠟包埋組織切片

1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min，重復一次，以*脫掉石蠟。

2）室溫下用100%乙醇浸泡切片5min，重復一次。

3）室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3min。

4）用PBS輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。

6）每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20min。

【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。

7）用PBS溶液潤洗樣本，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

B. 組織冰凍切片

1）將玻片浸沒在4%多聚甲\醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育15min。

2）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

3）將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15min。

4）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。

6）每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10min。

【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。

7）用PBS溶液潤洗樣本2-3次。

8）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

C. 細胞爬片的準備

在Lab-Tek載玻片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后，用PBS洗2遍載玻片。

D. 細胞涂片的制備

1）準備多聚賴氨酸包被的載玻片：吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液，滴至每一片預清洗過的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細胞的區(qū)域將多聚賴氨酸溶液涂散為一薄層。待載玻片晾干之后，迅速用去離子水漂洗，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60 min。包被后的載玻片能在室溫儲存數(shù)月。

2）以約2×107個細胞/ml的濃度將細胞重懸于PBS中，吸取50-100μl細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液。

3）固定細胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。

4）洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5min。重復用PBS洗一次。

5）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

6） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。

7）每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5min進行通透處理）。

【注】：Proteinase K幫助組織和細胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。

8）在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次。

9）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

二、DNA酶處理陽性對照的步驟（可選）

在樣本通透處理后，用DNA酶I處理細胞來準備陽性對照載玻片。該流程通常會引起被處理的大多數(shù)細胞顯現(xiàn)綠色熒光。

【注】：DNA酶I處理固定的細胞會引起染色體DNA的斷裂，產(chǎn)生許多可標記的DNA 3’-末端。

1） 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個樣本需用200 µl 1×DNase I Buffer，即需要用20µl 10×DNase I Buffer和180 µl去離子水混合稀釋)，取其中100 µl滴加到已通透的樣本上，室溫孵育5min。 向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I (1U/μl)，使其終濃度為10 U/ml。輕叩掉液體，加入100μl含5.5-10 units/ml DNase I的緩沖液，室溫孵育10min。

2）輕輕叩掉液體，加入100μl含10U/ml DNase I 的緩沖液，室溫孵育10min。

3）輕叩載玻片，去掉多余的液體，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中*洗3-4次。

【注】：陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸，否則陽性對照載玻片上殘余的DNase I 可能會在實驗載玻片上引入高背景。

三、標記與檢測

1）按1:5的比例用去離子水稀釋5×Equilibration Buffer。

2）每個樣本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育10-30分鐘?；蛘邔⑤d玻片放入一個含有 1×Equilibration Buffer的缸中，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細胞的同時在冰上解凍FITC-12-dUTP Labling Mix，并且依照表1，準備足夠量的用于所有實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5cm2的一個標準反應，其體積是50μl，用50μl乘以實驗和陽性對照反應的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本，可成比例的增大試劑體積。

表1. 準備用于實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液

陰性對照體系：準備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液，用ddH2O替代TdT酶。

3）在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在5cm2面積的細胞上加入50μl TdT孵育緩沖液。不要讓細胞干掉。這之后的操作，載玻片要避光。

4）把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內，在37℃孵育60min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。

【注】：塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

5）移除塑料蓋玻片，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5min。

6）輕輕去掉多余液體，換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5 min，重復一次。

7） 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。注意：為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗3次，每次5min，這樣可將游離的未反應標記物清除干凈。

8） 樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液（1μg/ml，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，室溫放置5min。可選操作：樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液（2μg/ml，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，室溫放置5min。

9）洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5min，重復2次，總共洗3次。

10）叩干載玻片上多余的水并且用吸水紙擦拭細胞周邊的區(qū)域。

11）立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標準的熒光過濾裝置在520±20nm的熒光下觀察綠色熒光；在＞620nm下觀察PI的紅色熒光，或在460nm觀察藍色的DAPI。如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放一個晚上。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

四、利用流式細胞術檢測懸浮細胞

1）將3-5×106個細胞用PBS在4℃離心（300×g）洗兩次，然后重懸在0.5ml PBS中。

2）固定細胞，加入5ml 1%配制于PBS中的多聚甲\醛溶液，冰上放置20min。

3）細胞在4℃300×g離心10min，去上清并且重懸于5ml PBS。重復洗一次，并用0.5 ml PBS重懸細胞。

4）通透細胞，加入5ml冰上預冷的70%乙醇，在-20℃孵育4小時。細胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周，或者，細胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置5min。

5）細胞在300×g離心10min，并用5 ml PBS重懸。重復離心，并1ml PBS重懸。

6）轉移2×106個細胞至一個1.5ml的微量離心管。

7）300×g離心10min，去上清，并用80μl 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5min。

8）在平衡細胞的同時，在冰上融解FITC-12-dUTP標記混合物，并且依照表1，準備足夠量的用于所有反應的TdT孵育緩沖液。對于2×106個細胞的一個標準反應，其體積是50μl，用50μl乘上反應數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。

9）細胞在300×g離心10min，去上清并把沉淀重懸在50μl TdT孵育緩沖液中，37℃孵育60min，避光。每隔15min用微量移液器輕輕重懸細胞。

10）加入1ml 20mM EDTA終止反應，用微量移液器輕柔混勻。

11）300×g離心10min，去上清并把沉淀重懸在1ml配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液，其中含5mg/ml BSA，重復一次，總共洗2次。

12）300×g離心10min，去上清并把細胞沉淀重懸在0.5ml PI溶液（5μg/ml）中，其中包含250μg 無DNA酶的Rnase A。

13）在黑暗中室溫孵育細胞30min。

14）用流式細胞儀分析細胞，測量520±20nm的FITC-12-dUTP的綠色熒光和＞620nm的PI紅色熒光。PI將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色，只在凋亡細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

實驗舉例（3T3-L cell）

陰性對照

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