在科學研究的前沿，賽多利斯的Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)已成為眾多CNS論文的?？停ㄏ嚓P閱讀：一天三篇CNS，Incucyte開啟細胞研究新速度）。而在今年的9月13日，又有兩篇CELL論文借助Incucyte®展示了更為豐富的數(shù)據(jù)。陳老師對此進行了深入分析，揭示了活細胞成像在這些研究中的關鍵作用，帶來更加“可視化” 的科學視角。
01
植入“木馬”分子治療神經(jīng)退行性疾病[1]
蛋白質(zhì)聚集會導致廣泛的神經(jīng)退行性疾病。例如，在阿爾茨海默病患者的大腦中，tau蛋白和淀粉樣蛋白錯誤折疊并積聚成細絲狀聚集物。靶向和去除聚集體，而不是功能性蛋白，是一個相當大的挑戰(zhàn)。本文發(fā)現(xiàn)了一種稱為“RING-Bait”的治療策略，RING是TRIM21蛋白的一個結(jié)構域，用來標記“垃圾”蛋白，并將其交由細胞的“垃圾處理工廠”蛋白酶體進行降解。Bait就是聚合蛋白的單體序列。RING-Bait融合蛋白與聚集蛋白序列結(jié)合，被募集到聚集體中，從而導致聚集體被蛋白酶體降解。RING-Bait可以特異性降解tau聚集體的同時保留可溶性 tau。
圖1. RING-Bait示意圖：RING-Bait作為tau聚集體的“木馬”分子，介導tau聚集體的降解
本文使用了穩(wěn)定表達與綠色熒光蛋白融合的 P301S 0N4R tau（病理突變的tau蛋白）的HEK293細胞（以下簡稱“TV 細胞”）。先前研究表明，在轉(zhuǎn)染試劑作用下，TV細胞通過形成大而明亮的tau亮點狀來響應外源供應的tau聚集體?？梢酝ㄟ^Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)來追蹤tau 聚集體的生成（圖2，3）。
圖2. Incucyte®系統(tǒng)對tau 聚集體的亮點狀進行圈描，并對其總面積進行計算（上圖為原圖，下圖黃色區(qū)域為tau 聚集體的圈描）
圖3. TV 細胞在 Incucyte®系統(tǒng)中拍攝72小時，每2-4小時拍攝一次照片并進行分析。左圖為實時統(tǒng)計的tau聚集體面積，發(fā)現(xiàn)tau-RING可以減少tau的聚集；右圖為終點計算結(jié)果
為了測試tau-RING是否依賴于泛素-蛋白酶體途徑（UPS），及與內(nèi)源性TRIM21相同的方式降解聚集體，加入E1 泛素激活酶抑制劑（TAK-243）、VCP抑制劑（NMS-873）和蛋白酶體抑制劑（MG-132）。這些抑制劑完全阻止了 tau-RING 介導的 TVA細胞tau聚集體降解，表明泛素化途徑是必不可少的（圖4）。
圖4. Incucyte®測試發(fā)現(xiàn)加入泛素-蛋白酶體途徑相關抑制劑，tau-RING對tau聚集體降解被阻止
為了達到RING-Bait序列的最佳效率，bait（誘餌）和基材（聚合蛋白單體序列）需要在結(jié)構上兼容，以便將誘餌有效地摻入目標聚集體中。在人類tau蛋白病中，不同疾病中的細絲由不同的tau亞型組成。在家族性tau蛋白病中，WT tau與突變tau的整合是突變依賴性的。因此探索了WT 0N4R tau-RING 在去除攜帶 P301S 突變聚集體的功效。WT 0N4R tau-RING 在降解 TVA 細胞中的聚集體方面不如 P301S 0N4R tau-RING 有效（圖5）。這表明P301S 突變的 tau與WT tau自聚的效率比較低。
圖5. Incucyte®測試發(fā)現(xiàn)WT 0N4R tau-RING 在降解 TVA細胞中的聚集體方面不如 P301S 0N4R tau-RING 有效
動物實驗中，RING-Bait 去除了從阿爾茨海默?。ˋD）和進行性核上性麻痹（PSP）腦提取物中播種的 tau 聚集體，并延長了其存活時間。RING-Bait 策略可以通過替換 Bait 序列以匹配目標聚集體來應用于其他神經(jīng)退行性疾病的治療。
02
可能的下一代腫瘤免疫新療法[2]
線粒體丟失和功能障礙會導致T細胞耗竭，這是基于T細胞的免疫療法成功的主要障礙。本文發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細胞與T細胞建立納米管連接，并利用這些細胞間高速公路將基質(zhì)細胞線粒體移植到CD8 T細胞中。這些捐獻線粒體的T細胞擴增更穩(wěn)健，浸潤腫瘤的效率更高，并且與不吸收線粒體的T細胞相比，表現(xiàn)出更少的耗竭跡象和增強的抗腫瘤反應。
為了評估線粒體轉(zhuǎn)移是否也能提高人抗腫瘤 T 細胞療效，研究使用Incucyte®評估了 CD19-CAR T細胞對熒光標記的 NALM6（一種侵襲性 CD19 人 B 細胞淋巴細胞白血病細胞系）的細胞毒能力。與 Mito-細胞（未注入線粒體）的T細胞相比，Mito+細胞（注入線粒體）的T細胞表現(xiàn)出顯著增加的腫瘤殺傷能力，線粒體功能失調(diào)的T細胞（Mito EtBr）并沒有增強抗腫瘤活性，證明在Mito+ T細胞的功能是由供體線粒體驅(qū)動的（圖6A）。
為了確定線粒體轉(zhuǎn)移是否賦予 CD19-CAR T 細胞對耗竭的抵抗力，評估了線粒體細胞在腫瘤細胞重復攻擊下殺死 NALM6 細胞的能力。Mito+細胞在六輪刺激中保持對癌細胞的強大細胞毒活性，而 Mito-細胞在第三輪開始失去殺傷能力，到第六輪幾乎完全耗盡了功能（圖6B，6C）。
圖6. Incucyte®系統(tǒng)每 2 小時測量一次腫瘤細胞的 GFP 熒光強度，共拍攝48-72小時；B為六輪殺傷結(jié)果，C為終點信號的拍攝的結(jié)果（腫瘤球）
移植健康線粒體的能力可能與 TIL（腫瘤浸潤淋巴細胞）應用特別相關，因為它們的內(nèi)源性線粒體經(jīng)常被腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的敵對條件造成不可修復的損害。當用 SK23-GFP（一種表達靶抗原 MART-1 的黑色素瘤細胞系）和Mito- TIL或Mito+共培養(yǎng)。Mito+TILs介導的腫瘤清除率更高（圖7）。為了探索供體線粒體是否也可以來自原代 BMSC（骨髓基質(zhì)細胞），將 MART-1 TIL 與來自三個不同供體產(chǎn)生的臨床級原代 BMSCs 共培養(yǎng)。Mito+ TILs 始終表現(xiàn)出對增強的靶癌細胞的細胞毒性 。
圖7. 使用Incuyte®對Mito+和Mito-的TIL對SK1-GFP黑色素瘤的細胞毒性測定。（E：T比例1：5）。供體線粒體來源于永生化（I）或原代BMSC（J）
這些發(fā)現(xiàn)將細胞間線粒體轉(zhuǎn)移確立為細胞器醫(yī)學的原型，為下一代細胞療法開辟了途徑。
這些文章看中了
Incucyte®哪些優(yōu)點呢？
培養(yǎng)箱內(nèi)可長達數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害和移動；如第二篇文章就測試了6輪免疫細胞殺傷，耗時2周左右
多個板位，分別獨立設置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高；如第一篇文章就利用Incucyte®的高通量測試了多種抑制劑的影響
具有劃痕，腫瘤球，類器官，趨化，血管生成等多個分析拍攝模塊，并配套相應的耗材；如第二篇文章使用了腫瘤球模式層掃拍攝
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-參考文獻-
[1] Co-opting templated aggregation to degrade pathogenic tau assemblies and improve motor function.cell
[2] Intercellular nanotube-mediated mitochondrial transfer enhances T cell metabolic fitness and antitumor efficacy.cell
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