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自動、定量、可視化？匯合度定量細(xì)胞增殖與毒性全攻略
細(xì)胞增殖是細(xì)胞數(shù)量隨時間增加的生物學(xué)過程，是正常組織發(fā)育、再生和更新的重要機(jī)制。增殖的異?？赡茉斐蓯鹤兒桶┌Y病理。細(xì)胞毒性則指物質(zhì)或環(huán)境變化對細(xì)胞健康的有害影響。細(xì)胞經(jīng)毒性刺激處理后可能會損害代謝活性，抑制細(xì)胞生長，甚至通過復(fù)雜的生物學(xué)途徑（如細(xì)胞壞死或細(xì)胞凋亡）導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在細(xì)胞密集堆積或形態(tài)發(fā)生顯著變化之前，細(xì)胞匯合度是評估細(xì)胞增殖和毒性的理想指標(biāo)。
Incucyte® 實(shí)時活細(xì)胞分析系統(tǒng)能夠在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行長時程的實(shí)時自動化的檢測，通過分析細(xì)胞圖像面積隨時間的變化（匯合度百分比），實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖可視化和定量檢測，并分析細(xì)胞毒性。
圖1. 左上圖為原始圖片，左下圖為圈描的細(xì)胞（黃色），右圖為根據(jù)總細(xì)胞面積（confluency）繪制的生長曲線。
今天，陳老師將與大家分享幾篇精彩的研究，展示如何使用Incucyte® 進(jìn)行抗增殖作用和細(xì)胞毒性評估。
針對藥物篩選的細(xì)胞增殖與毒性測試
威斯康星醫(yī)學(xué)院[1]
N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一種含硫醇基團(tuán)的抗氧化劑，已被用作癌癥生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)中的抗氧化藥物。其作用歸因于硫醇基團(tuán)在線粒體中的抗氧化和氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而NAC的生物利用率很低，需要高濃度才可以發(fā)揮功效。大量的體內(nèi)外癌癥研究發(fā)現(xiàn)，將三己基膦（TPP+）通過烷基側(cè)鏈共軛到藥物上，會使其選擇性靶向癌細(xì)胞線粒體的作用顯著增強(qiáng)。為了確定線粒體靶向硫醇對癌細(xì)胞增殖的影響，本文作者通過連接含有TPP+分子的烷基側(cè)鏈，合成了線粒體靶向的Mito10-NAC及其甲基類似物（圖2）。
圖2. NAC，Mito10-NAC以及其甲基類似物結(jié)構(gòu)圖。
隨后，作者使用Incucyte® 實(shí)時活細(xì)胞分析系統(tǒng)連續(xù)一周監(jiān)測了以上6種硫醇分子對人胰腺癌（MiaPaCa-2）、人乳腺癌（MDAMB-231和MCF-7）、人非小細(xì)胞肺癌（A549）細(xì)胞系，以及作為對照的非惡性乳腺癌細(xì)胞系（MCF-10A）的細(xì)胞增殖影響。通過Incucyte® AI Confluence軟件，對捕獲的圖像進(jìn)行自動化的匯合度增殖定量分析。
結(jié)果顯示，與非靶向母藥相比，線粒體靶向NAC的抗增殖能力顯著增強(qiáng)，且甲基化進(jìn)一步提升了其抗增殖效果。NAC需要較高的濃度才能表現(xiàn)出一定的生物活性，但是會顯著地影響正常細(xì)胞增殖。相較之下，Mito10-NAC則不僅低濃度就具備更好的生物活性，而且還不影響正常細(xì)胞的增殖生長。
圖3. Incucyte® 軟件的自動匯合度定量分析結(jié)果：NAC, Mito10-NAC以及其甲基類似物對MiaPaCa-2增殖作用的影響。所示數(shù)據(jù)為平均值± SD, n = 4 。Bar值小，重復(fù)性良好。真實(shí)反映了不同藥物濃度下細(xì)胞匯合度隨時間的變化；曲線旁邊的高清細(xì)胞圖像為對照細(xì)胞系的匯合度達(dá)到90%時（黑色豎線對應(yīng)的時間點(diǎn)）對應(yīng)的MiaPaCa-2細(xì)胞圖像，黃色圈描展示了Incucyte® 對細(xì)胞外輪廓的準(zhǔn)確識別，進(jìn)而提供實(shí)時的匯合度定量分析。
Incucyte® 可自動計(jì)算IC50值[1]
基于Incucyte® 監(jiān)測分析結(jié)果進(jìn)一步計(jì)算不同細(xì)胞系的IC50值，結(jié)果顯示，與非靶向母藥相比，靶向線粒體的硫醇分子具有的癌細(xì)胞增殖抑制效力普遍增強(qiáng)100-500倍，Mito10-NAC高達(dá)1500-2400倍（圖4）。也同時反映Mito10-NAC及其甲基類似物的抗細(xì)胞增殖作用可能與NAC清除活性氧或活性氮的抗氧化機(jī)制并無關(guān)聯(lián)。
圖4. 線粒體靶向藥物和相應(yīng)母體化合物對MiaPaCa-2的細(xì)胞增殖抑制作用比較。
用于最佳細(xì)胞接種密度篩選[2]
低級別漿液性癌 （LGSOC） 是一種罕見的上皮性卵巢癌。由于治療選擇有限，需要更有效的療法來治療復(fù)發(fā)性疾病。為了解決這個問題，在 12 種患者來源的 LGSOC 細(xì)胞系和 1 種正常卵巢細(xì)胞系中進(jìn)行高通量藥物篩選工作。為了建立細(xì)胞系生長動力學(xué)和最佳接種密度，將細(xì)胞系接種黑色384孔板中，并放置過夜。在 Incucyte®中以8小時的間隔拍攝相差圖像（放大倍數(shù)10×），至少持續(xù) 168 小時，每 96 小時更換一次培養(yǎng)基。使用 Incucyte®評估細(xì)胞匯合度。選擇掃描后 72 小時達(dá)到 70-80% 匯合度所需的最低接種密度進(jìn)行高通量藥物篩選。
圖5. 以每孔 250–4500 個細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，每個接種密度測試一式四份孔。Bar值小，重復(fù)性良好。
長時間活細(xì)胞檢測以確定藥物耐藥性[3]
解旋酶WRN通過多次基因篩選被鑒定為具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）癌細(xì)胞中的合成致死靶點(diǎn)。HRO761是一種有效的、選擇性的、變構(gòu)的WRN小分子抑制劑， 而伊立替康是一種用于晚期大腸癌治療的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。研究表明，HRO761和伊立替康在低效濃度下的聯(lián)合使用，能顯著增強(qiáng)SW48細(xì)胞的抗增殖活性。在較高劑量的HRO761下，它能阻止體外細(xì)胞的長期再生（長達(dá)40天的跟蹤）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了HRO761和伊立替康聯(lián)合用藥的效果，使腫瘤完全消退。
圖6. Incucyte® 生成的匯合圖展示了長期暴露于指定濃度的HRO761和伊立替康（irinot.）組合的SW48細(xì)胞匯合情況，每7天換一次培養(yǎng)基；而在較高劑量的HRO761下，它阻止了體外細(xì)胞的長期再生。
使用Incucyte® 的關(guān)鍵優(yōu)勢
培養(yǎng)箱內(nèi)可長達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細(xì)胞的傷害
Incucyte® AI Confluence軟件借助AI大數(shù)據(jù)驅(qū)動功能，對細(xì)胞邊界進(jìn)行準(zhǔn)確識別，自動定量細(xì)胞匯合度隨時間的變化，可以實(shí)現(xiàn)更直觀、更可靠的細(xì)胞增殖監(jiān)測分析
多個板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高
具有劃痕、腫瘤球、類器官、趨化、血管生成等多個分析拍攝模塊，并配套相應(yīng)的耗材
高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標(biāo)多參數(shù)，使得結(jié)果更加準(zhǔn)確
大于100種優(yōu)化過的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol
文章數(shù)>15,000篇，認(rèn)可度廣
Incucyte®長時程活細(xì)胞成像系統(tǒng)應(yīng)用文集
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為了將Incucyte®推廣到更多的活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，我們致力于提供全面的應(yīng)用解決方案?！禝ncucyte®長時程活細(xì)胞成像系統(tǒng)應(yīng)用文集》除了基礎(chǔ)的細(xì)胞增殖和活性監(jiān)測外（如細(xì)胞凋亡/周期/毒性等），還涵蓋了抗體內(nèi)化、旁觀者效應(yīng)、共培養(yǎng)殺傷、炎癥反應(yīng)（NETosis）、細(xì)胞吞噬、劃痕實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞趨化、類器官研究、腫瘤球分析、神經(jīng)突生長、ATP 檢測、線粒體膜電位、病毒/脂質(zhì)體/外泌體監(jiān)測、全孔成像等多個方面。應(yīng)用范圍廣，是您尋找實(shí)驗(yàn)方法的有利工具。
-參考文獻(xiàn)-
[1] Cheng, G., Hardy, M. & Kalyanaraman, B. Antiproliferative effects of mitochondria-targeted N-acetylcysteine and analogs in cancer cells. Sci Rep 13, 7254 (2023).
[2] High-throughput drug screening identifies novel therapeutics for Low Grade Serous Ovarian Carcinoma | Scientific Data (nature.com)
[3] Discovery of WRN inhibitor HRO761 with synthetic lethality in MSI cancers | Nature