上海信帆生物組織開展了：細胞樣本的前處理和保存的培訓活動

上海信帆生物組織開展了：細胞樣本的前處理和保存的培訓活動

很多老師在收集樣本的時候，樣本是細胞樣本，不清楚應該如何進行前處理，如果保存，今天讓我們跟著上海信帆生物一起來了解一下細胞樣本的前處理方法吧！

一、勻漿介質(zhì)

一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。

二、細胞樣本的前處理:

1、細胞沉淀的收集：

① 懸浮細胞: 對于懸浮培養(yǎng)的細胞，直接通過離心收集細胞沉淀，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

② 貼壁細胞: 對于貼壁培養(yǎng)的細胞，用胰酶將細胞消化下來，或用細胞刮將細胞刮下來，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

我們一般建議客戶，細胞密度好不要小于一百萬個/ml。

2、細胞沉淀的洗滌：

在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS （等滲）， 輕輕顛倒混勻，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

重復上述操作反復洗滌1～2次。

3、勻漿的方式：手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。

① 手工勻漿：在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中，手動勻漿3分鐘，然后取破碎好的細胞懸浮液進行測定。

② 超聲破碎:

在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進行如下操作:

     a、用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。

      b、用超聲細胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重復4～5次。

③ 裂解液裂解 

常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強弱不同。

1、SDS屬于離子型去垢劑，厲害，基本可以把細胞*破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得很粘稠。

2、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會使蛋白變性失活）。

去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進行裂解。

④ 反復凍融:

在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結冰，溶解，再結冰，再溶解，反復3次左右）。

                由于反復凍融對酶活力影響較大,一般不推薦使用

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