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Real-time qPCR如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

時間：2023/3/21閱讀：1011
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Real-time qPCR如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析


1. Real-time qPCR常見參數(shù)

基線（baseline）

通常是3-15個循環(huán)的熒光信號

同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線

閾值（threshold）

自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團(tuán)的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

2. 影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。


另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99 時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。


標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。

如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就小；如果許多數(shù)據(jù)點都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250


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