【資料】關于活體生物發(fā)光成像技術的標記原理

哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Fireflyluciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達?；?、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標記細胞的數(shù)目線性相關。

除Firefly Luciferase外，有時也會用到RenillaLuciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540~600nm，后者所發(fā)的光波長在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用FireflyLuciferase作為報告基因，如果需要雙標記，也可采用后者作為備選方案。

熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應，生成氧化熒光素（oxyluciferin），并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。

對于細菌標記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達。
在經(jīng)過實踐探索后，我們已經(jīng)采用慢病毒載體標記了一系列腫瘤細胞株，如肝癌，肺癌，乳腺癌，黑色素瘤等，用于活體成像實驗，而且新引進了2A連接序列，luciferase2 發(fā)光強度可以達到的水平，大大提高了檢測的靈敏度。做藥物是不錯的選擇啊。