上海信帆生物：新方法可生物試劑針對MMP胞外區(qū)域的高性能抗體

抗體藥物作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力，能安全有效地對癌癥、自身免疫病和感染性疾病等進(jìn)行靶向治療，該藥物在2012年創(chuàng)下645.7億美元的銷售額，占生物制藥51.8%的份額。目前抗體藥物的市場需求量仍在攀升，預(yù)計(jì)到2015年，抗體藥物銷售額有望達(dá)980億美元左右。業(yè)內(nèi)人士認(rèn)為，隨著疾病譜變化，抗體藥物的黃金時(shí)代已經(jīng)來到。

單抗藥物的作用靶點(diǎn)很重要的一部分是行使細(xì)胞功能*的跨膜蛋白，包括多通道膜蛋白MMP(如g蛋白偶聯(lián)受體)和離子通道，這些蛋白也是診斷檢測的重要分析靶點(diǎn)。目前跨膜蛋白占據(jù)了40%以上的單抗藥物靶點(diǎn)，而成功被單抗藥物靶向結(jié)合的僅占少數(shù)。

多數(shù)MMP的抗體已用于商業(yè)用途，不過其中的絕大多數(shù)表現(xiàn)不佳，通常局限在western blot等研究領(lǐng)域。而一些MMP的單克隆抗體在活細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選和功能分析時(shí)具有用處，然而在制備過程中生成量少且難度和成本都很高。

膜蛋白功能受其三維結(jié)構(gòu)支配，對于抗體而言，要想對細(xì)胞的生理效應(yīng)施加影響必須結(jié)合在膜蛋白上，事實(shí)上膜蛋白中僅有胞外片段才適合抗體結(jié)合。從結(jié)構(gòu)上看，由不連續(xù)片段(或環(huán)狀結(jié)構(gòu))構(gòu)成的MMP胞外區(qū)域，是多段經(jīng)細(xì)胞膜分隔的多肽序列，其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)在缺乏膜的情況下無法形成。

X射線晶體學(xué)研究表明，抗體結(jié)合位點(diǎn)(CDR)的“足跡”是一段面積約20X30埃的區(qū)域構(gòu)成，圖一示意鼠源單抗藥物ADORA2A的結(jié)合位點(diǎn)和胞外區(qū)域的相對大小。ADORA2A足跡具有56個(gè)氨基酸構(gòu)成的胞外面積，這足以接觸G蛋白偶聯(lián)受體的整個(gè)胞外片段(GPCR胞外的多肽片段處于50至125個(gè)氨基酸之間)。

高性能抗體

為了研制針對MMP胞外片段的高性能抗體，研究人員必需對動(dòng)物進(jìn)行免疫接種并收集一些能識別膜蛋白結(jié)構(gòu)(作為抗原足以接觸抗體同時(shí)具有高親和性)的抗體。值得注意的是，短的線性多肽抗原不能折疊成自然3維結(jié)構(gòu)因而不能作為膜蛋白胞外區(qū)域的重要部分，此外，提純的完整膜蛋白即便包括完整的胞外區(qū)域也不能用于功能抗體的研發(fā)，因?yàn)槠湓谌鄙倌さ闹С窒虏荒苷郫B成天然結(jié)構(gòu)。

研究人員經(jīng)常利用病毒樣顆粒(VLPs)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞(表達(dá)特定的靶標(biāo)分子)研制出MMP抗體，但是這一方法面臨的問題是，其它非靶標(biāo)蛋白的存在使得特定抗體分子的生成量極其低。為了改變可用抗體不足以及制造成本高的現(xiàn)狀，SDIX公司研制出新方法可生物試劑針對MMP胞外區(qū)域的高性能抗體。

DNA免疫操作是新方法的核心，其誘導(dǎo)的抗體免疫要明顯強(qiáng)于VLP或轉(zhuǎn)染細(xì)胞誘導(dǎo)的。經(jīng)研究，DNA免疫能夠在免疫動(dòng)物細(xì)胞膜上合成高純度的MMP靶定分子，尤為重要的是，新表達(dá)的蛋白在其它外源分子沒有干擾的條件下刺激免疫系統(tǒng)地合成抗體。此外，由于MMP分子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，可繞開提純或蛋白失活等問題，這對于高度脆性和易失活的MMP分子而言是極其重要的。從技術(shù)流程上看，免疫接種后利用融合技術(shù)獲取雜交瘤細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀高通量篩選那些表達(dá)MMP靶標(biāo)分子的細(xì)胞。

單一抗原的多個(gè)抗體表位

為了驗(yàn)證DNA免疫技術(shù)的有效性，研究人員研制出3種MMP分子(GPCRs CXCR4，ADORA2A和 CD20)的單克隆抗體。值得肯定的是，這項(xiàng)技術(shù)誘導(dǎo)出針對單一MMP分子的大量單克隆抗體(它們具有*的結(jié)合位點(diǎn)和潛在功能)，從雜交瘤細(xì)胞中分別篩選出93種CXCR4單抗、15種ADORA2A單抗以及51種CD20單抗。

對抗體基因序列的分析得出，抗體高度多樣化地應(yīng)對3種MMP分子。93種CXCR4單抗中有75種有*序列，而15種ADORA2A單抗和51種CD20單抗中有*序列的分別是14和34種。

那些表達(dá)MMP突變基因的細(xì)胞經(jīng)表位圖譜分析后也表現(xiàn)出多樣性。目前已知的CXCR4單抗主要結(jié)合在胞外的第二圓環(huán)，但是來自DNA免疫動(dòng)物的CXCR4表現(xiàn)出8種不同的結(jié)合模式;同樣地，大多數(shù)現(xiàn)有的CD20單抗可分為2大類(利妥昔單抗樣和ofatumumab樣)，而來自DNA免疫動(dòng)物的CD20單抗表現(xiàn)出9種已知的和未知的特點(diǎn)。DNA免疫過程中溫和的抗原遞呈方式可解釋表位模型的多樣化，而新發(fā)現(xiàn)的表位可能在傳統(tǒng)的蛋白免疫過程中被破壞掉。

來自DNA免疫動(dòng)物的單克隆抗體可與現(xiàn)有的單抗藥物想媲美。在流式細(xì)胞試驗(yàn)中，SDIX公司研制的單克隆抗體表現(xiàn)出高親和性和反應(yīng)*性，其研制的所有ADORA2A單抗在流式細(xì)胞試驗(yàn)中反應(yīng)強(qiáng)烈，而CXCR4和CD20的多種單克隆抗體要比現(xiàn)有基準(zhǔn)抗體具有更高的親和性。

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