上海信帆生物：全新的蛋白相互作用分析工具

在細胞中，蛋白質并不是孤單的個體。大多數蛋白通過與分子伴侶或其他蛋白形成復合物而發(fā)揮其功能。因此，在了解細胞的生物學特性時，蛋白質相互作用（PPI）研究就成了重要一環(huán)。在藥物開發(fā)的過程中，這一信息也至關重要，有助于確認藥物靶點。

一提起蛋白質相互作用研究，你的腦海中可能馬上浮現出：酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術。的確，這些都是經典方法，可有效檢測體內體外蛋白質相互作用。然而，它們不能提供動態(tài)的蛋白相互作用信息，似乎還缺乏一些說服力?；诖?，共振能量轉移這種方法受到人們的青睞。這種能量轉移有著嚴格的距離限制（< 10 nm），特別適合評估蛋白質的相互作用。

它的原理并不復雜，就是兩個蛋白分子靠近時，激發(fā)態(tài)能量從一個熒光基團轉移到另一個。生物發(fā)光共振能量轉移（BRET）和熒光共振能量轉移（FRET）都屬于這種方法。它們的主要區(qū)別在于，FRET涉及到兩個熒光基團之間的能量轉移，其中一個需要適當光源的外部激發(fā)，而BRET在底物被氧化之后發(fā)生，因此不需要外部激發(fā)。如此看來，BRET相對FRET有不少優(yōu)點，比如無需激發(fā)光，背景更低，也避免了光漂白和自發(fā)熒光等問題。

BRETzui初是在海洋生物中觀察到的，如水母和海腎。之后，人們將其用于動物和植物研究。在BRET技術中，蛋白A融合螢光素酶（通常是海腎螢光素酶），作為能量供體，蛋白B則融合帶有熒光基團的標簽蛋白，作為能量受體。如果蛋白A和B存在相互作用，加入螢光素酶底物后，螢光素酶發(fā)光可以激發(fā)鄰近的蛋白B的熒光基團發(fā)光。如果沒有相互作用，那就沒有熒光咯。

大幅改良的BRET平臺

目前，人們大多使用海腎螢光素酶（Rluc）作為能量供體，黃色熒光蛋白（YFP）作為能量受體，在這之間實現能量轉移。然而，Rluc和YFP的光譜接近，產生了明顯的背景。這種高背景增加了檢測噪音，也降低了靈敏度和動態(tài)范圍。

于是，Promega對BRET方法進行大幅改良。它使用NanoLuc® 螢光素酶作為能量供體，而HaloTag® 蛋白標記的NanoBRET™ 618熒光基團作為能量受體，帶來了的NanoBRET™ 技術。

集兩大于一身的NanoBRET™，可不是鬧著玩的。NanoLuc® 螢光素酶的分子量僅為19 kDa（171個氨基酸），更適合于構建融合蛋白。別看它小，它的光信號比海腎螢光素酶高兩個數量級，因此極少量也能準確定量，特別適合細胞水平蛋白相互作用的研究。

至于能量受體，Promega利用HaloTag® 蛋白標簽技術來構建。在評估了一系列熒光基團之后，他們選擇了NanoBRET™ 618配基。它與NanoLuc® 的波長配對更加，使得檢測數據更加出眾。于是，來自NanoLuc® 供體的明亮的藍移發(fā)光信號耦合到遠紅移的HaloTag® 受體上后，光譜疊加更佳、信號更強、且與傳統(tǒng)的BRET分析相比背景更低。

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