過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒說明書

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過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒說明書
測定意義：
微量法 100 管/96 樣 CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是zui主要的 H2O2 清除酶， 在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。
測定原理：
H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解 H2O2，使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反 應(yīng)時(shí)間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出 CAT 活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、 研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 125μL×1 瓶，4℃保存。 粗酶液提?。?1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備 收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置 冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 240nm，蒸餾水調(diào)零。 2、CAT 檢測工作液的配制：用時(shí)在試劑二中加入 25mL 試劑一，充分混勻，作為工作液。 3、測定前將 CAT 檢測工作液在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。 4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 190μL 工作液，立即混勻并計(jì)時(shí)，記錄 240nm 下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計(jì)算 ΔA＝A1-A2。 CAT 活性計(jì)算： a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下 1、血清（漿）CAT 活力的計(jì)算: 單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/mL)= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=459×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算： （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=459×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
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單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/104 cell)＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T =0.917×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：H2O2 摩爾消光系數(shù)，4.36×104 L / mol /cm；d：比 色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反 應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬。
b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）CAT 活力的計(jì)算: 單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/mL)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=918×ΔA 2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計(jì)算： （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr （2）按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=918×ΔA÷W （3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個(gè)酶活力單位。 CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=1.836×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：H2O2 摩爾消光系數(shù)，4.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總 數(shù)，500 萬。