丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒操作步驟詳解

丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒

測定意義 PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是丙酮酸脫氫酶復合體(PDHC)催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。

測定原理 PDH催化丙酮酸脫氫，同時還原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導致600nm光吸收的減少。 需自備的儀器和用品 可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 試劑的組成和配制 試劑一：50mL×1瓶，-20℃保存； 試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存； 試劑三：1mL×1支，-20℃保存； 試劑四：液體50mL×1瓶，4℃保存； 試劑五：粉劑×1支，4℃保存； 試劑六：粉劑×1支，4℃保存； 試劑七：粉劑×1支，4℃保存； 試劑八：粉劑×1支，4℃保存; 工作液的配制：臨用前把試劑五、試劑六、試劑七和試劑八轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解待用。 PDH的提取
1、 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、 4 ℃ 600 g離心5min。
3、 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心10min。
4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PDH（此步可選做）。
5、 在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（功率20％，超聲3秒，間隔10秒，重復30次），用于PDH活性測定。
丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒測定步驟
1、 調(diào)零
用蒸餾水于605nm處調(diào)零。
2、 樣本測定
（1）取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中孵育5min。 （2）取出比色皿，加入50μL酶液，混勻；立即記錄605nm處初始吸光值A1，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）中準確反應1min，記錄605nm處1min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。 注意事項 1、測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。 2、比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。
3、兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。

PDH活性計算 1、組織中PDH活性計算: （1） 按樣本蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性（U/mg prot）=反應總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) （2） 按樣本鮮重計算 單位的定義：每g組織在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH（U/g 鮮重）=反應總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL)=905×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL) 2、細菌或培養(yǎng)細胞中PDH活性計算： （1）按樣本蛋白濃度計算 單位的定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性（U/mg prot）=反應總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL) （2） 按細菌或細胞密度計算 單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH活性（U/104 cell）=反應總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應時間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10-3）×ΔA ÷細菌或細胞密度(104 cell /mL)=905×ΔA÷細菌或細胞密度(104 cell /mL)

丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒