ELISA試劑盒常見問題的原因分析和處理方法（1）

　酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)（ELISA）具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的篩查，如肝炎、HIV，也可應(yīng)用優(yōu)生優(yōu)育等。的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠的必要條件。試驗(yàn)中若不做好相關(guān)控制，易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽(yáng)性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象（空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻明顯偏高）是各級(jí)研究實(shí)驗(yàn)室常遇到的問題。現(xiàn)將ELISA實(shí)驗(yàn)操作中的影響因素總結(jié)如下： 
　　1標(biāo)本因素 
　　以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽(yáng)性；混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)；標(biāo)本凝固不全，在研究試驗(yàn)中，有時(shí)為了爭(zhēng)取時(shí)間而快速檢測(cè)，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；采血試管洗滌不*、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。 
　　因此血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)，禁用嚴(yán)重溶血的標(biāo)本。一般說來，在5 d內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于2～8℃，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長(zhǎng)易導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過1周測(cè)定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存；使用一次性玻璃試管或真空采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷，能吸附酶標(biāo)記物，不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠或一次性真空促凝采血管。 
　　2試劑因素 
　　ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA反應(yīng)試劑盒。因此，有些廠家為了保持較好的本底而采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果?；蚬こ炭乖^合成肽抗原有無抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工作抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，僅包括了HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV特異性抗菌素原。第三代試劑的敏感度大大提高了?；蚬こ炭乖c合成肽抗原的區(qū)別如下： 
　　基因工程抗原是抗菌素原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)。①分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗菌素原，分子量更大。②穩(wěn)定性好。包被抗原的穩(wěn)定性決定試劑盒的有效期，早期以合成肽為包裝抗原的試劑盒有效期只有3～4個(gè)月，改作基因工程抗原后有效期大大延長(zhǎng)了。③基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。④純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：分子量太小；一般只含有一個(gè)抗原決定簇；純度高；穩(wěn)定性差。 
　　國(guó)內(nèi)酶聯(lián)免疫試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%，99.3%，78%，89%，存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用劣質(zhì)的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽(yáng)性或假陰性。因此，選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。 
　　選擇試劑時(shí)應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差異小、操作方便、省時(shí)的優(yōu)良檢測(cè)試劑，國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室每年對(duì)各廠家的試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并定期評(píng)估結(jié)果，可作為選擇試劑的主要依據(jù)； 要注意試劑的批號(hào)和出廠日期，雖然試劑的有效期多為1年。選擇剛出廠的試劑使用；不同廠家的試劑不能混用。 
　　不同方法學(xué)的檢測(cè)試劑會(huì)使乙肝兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實(shí)際工作中，常用ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)為陽(yáng)性。除方法學(xué)的靈敏度外，還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的區(qū)別。。