MMP2/9活性檢測(cè)試劑盒（明膠酶譜法）組成以及檢測(cè)步驟

上海信帆生物代理銷售“MMP2/9活性檢測(cè)試劑盒（明膠酶譜法）"，現(xiàn)貨供應(yīng)。試劑盒可以檢測(cè)MMP2，MMP9以及proMMP-9。

試劑盒組成部分如下：

組成與儲(chǔ)存(50 assays)：
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, 4度
2. 10 × Substrate G,50 ml, -20度；
3. 10 × Buffer A, 50 ml,  4度, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；
4. 10 × Buffer B, 50 ml,  4度, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；
5. SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(#P1501), -20度

檢測(cè)步驟：
1. 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE
凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ?C 加熱5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加
入10 × substrate G 并使之稀釋10 倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
2. 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM
Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅
使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。陽
性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing
buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37?C 孵育1~5 小時(shí)。陽性
對(duì)照或者血中的MMP 通常37?C 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為
10 小時(shí)或過一夜。
6. 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見SDS-PAGE
凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置
不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及
活性。陽性對(duì)照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa
位置出現(xiàn)透明條帶。
7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決
辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。
MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。