抗體檢測通用ELISA操作流程（效價測定）

1.包被步驟：

1）用包被緩沖液配制1-10 μg/ml抗原溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）

2）向高結(jié)合力ELISA板（貨號80112）每孔加入100μl抗原溶液，覆以封板膜，室溫輕搖孵育2-6小時或4℃過夜

3）吸棄溶液，用洗滌緩沖液洗板2次

2.封閉步驟：

1）用封閉緩沖液母液配制工作液，每孔加入300 μl，室溫輕搖孵育2-6小時或4℃過夜

2）吸棄封閉液并在吸水紙上拍干，板子可立即使用或密封保存于4℃?zhèn)溆?/span>

抗體效價檢測：

1）用抗體稀釋液對免疫前/免疫后血清進行梯度稀釋（1:100至1:100,000），每孔加入100ul。覆以封板膜，室溫輕搖孵育30分鐘。

2）吸棄液體，用洗滌緩沖液洗板5次（每次200-300 μl，洗滌不充分會導(dǎo)致高背景）

3）用抗體稀釋液配制HRP標記抗兔二抗（1:5,000-1:20,000），每孔加入100μl（稀釋不當會導(dǎo)致顯色過弱或背景過高）

4）覆以封板膜，室溫輕搖孵育30分鐘

5）吸棄液體，洗板5次后拍干

6）每孔加入100 μl現(xiàn)成TMB底物溶液

7）覆以封板膜，室溫輕搖孵育至陽性孔出現(xiàn)藍色（最長15分鐘）

8）每孔加入100 μl終止液，藍色轉(zhuǎn)為黃色

9）450 nm波長下讀取吸光度

注：所有試劑需使用新槍頭及加液槽添加。除特異性抗原/抗體外，ELISA所需全部試劑均可通過試劑盒獲取。

注意事項：

1）本ELISA流程適用于針對純化抗原（蛋白質(zhì)或多肽）產(chǎn)生的抗體的定性檢測，不適用于血清或其他體液中抗體濃度的定量測定。

2）本流程默認一抗來自兔源，若使用其他宿主動物需選用相應(yīng)二抗。

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