1.介紹

沙星類（Quinones，QNs）抗生素（圖-1）是一類人工合成的新型殺菌性抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性以及毒副作用小、價格低廉等特點，被大量用于治療和預(yù)防水生動物疾病及促生長。但研究表明，所使用的抗生素僅20%～30%被魚類吸收，大部分進入環(huán)境中，而這部分抗生素再次進入食物鏈，可能導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中病菌耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致二次污染。這不僅影響到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且還威脅著生態(tài)環(huán)境的安全。水樣中殘留喹諾酮類抗生素，通過飲用進入人體，可能對人體肝臟功能造成嚴重損傷。因此，建立水環(huán)境中這類藥物的檢測方法尤為重要。目前，喹諾酮類藥物殘留檢測方法，主要包括HPLC-UV、HPLC-FLD、HPLC-DAD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS，另外還有熒光光譜法、毛細管電泳法和酶聯(lián)免疫法等。

圖-1. 16種沙星類抗生素的結(jié)構(gòu)式

2.儀器、試劑以及耗材

Reeko Fotector Plus全自動固相萃取儀（?？疲?/span>

MCX 固相萃取柱（Oasis，200 mg/6 mL）

液相色譜：（HPLC）Agilent 1260，質(zhì)譜檢測器（MS）Agilent 6410

氮氣吹干裝置：Reeko AutoEVA-60全自動平行濃縮儀

甲醇，乙腈（TEDIA 色譜純）；甲酸，氨水（優(yōu)級純）。

3.樣品制備與凈化

3.1固相萃取凈化條件

3.2 富集凈化

依次用甲醇（10mL）和水（10mL）以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，備用。取純凈水樣200mL，如為加標樣品，請加入標準品（100 µL，100 ppb），加入EDTA-MCIlvaine緩沖溶劑（50 mL，0.1 mol/L）調(diào)節(jié)水環(huán)境的pH為4，以5mL/min的速率經(jīng)固相萃取小柱富集后；用甲酸水溶液（pH=4.0）10 mL以10 mL/min速率淋洗；氣推后用10 mL的5%氨水甲醇以1.0mL/min的速率洗脫。收集的樣品在25 ℃，5 psi條件下濃縮至近干，流動相乙腈-水溶液（10：90，v/v，0.1 %甲酸）定容至1.0mL，供LC/MS-MS分析。全自動固相萃取方法見圖-2。

圖-2. Fotector Plus水中沙星抗生素固相萃取方法

4.液質(zhì)檢測條件

4.1 色譜柱條件

4.2 MRM參數(shù)

表-1. 16種抗生素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測參數(shù)

4.3 16種沙星類抗生素的保留時間譜圖

圖-3. 16種喹諾酮標準物質(zhì)的MRM色譜圖（5 ng/mL，進樣量10 µL）

5.樣品測試

5.1基質(zhì)效應(yīng)驗證

取純凈水樣，按照上述的樣品處理步驟后，氮吹至近干，加入標準使用液（1ppm，20 µL），定容成1mL，供LC/MS-MS檢測。如果基質(zhì)加標濃度準確，則可以直接用標準曲線對樣品進行定量；如果不準確，請使用含有基質(zhì)的工作曲線進行定量。

選擇定量離子的峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，做相關(guān)曲線，曲線為線性回歸，各點權(quán)重相等，擬合出工作曲線，要求R²>0.99；此曲線兩周需要重新配置一次。

5.2 樣品基質(zhì)加標測試

對桶裝純凈水和生活廢水進行加標實驗，加標濃度為低濃度（25 ng/L）、中濃度（50 ng/L）和高濃度（100 ng/L），結(jié)果如表-2所示：除了恩諾沙星和司帕沙星在76.9%~79.4%外，大部分的加標回收率在82.5%~114.2 %之間，RSD 1.5%~16.6%。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對水樣中16種喹諾酮抗生素進行檢測。

表-2不同水樣的加標回收率

5.3 不同類型固相萃取柱對沙星類化合物的富集效果

取純凈水為樣品，加標的質(zhì)量濃度分別為50 ng/L，按照上述方法，進行4平行樣測定，考察該方法的不同固相萃取柱的回收率和重現(xiàn)性，分析結(jié)果如圖-4所示：純凈水中抗生素的平均回收率分布在65.00%-91.38%（HLB），71.21%-152.28%（MAX）和77.41 % -123.21 %（MCX）。HLB回收率普遍偏低，MAX柱中沙星的回收率偏高，培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超過了140 %，而且MAX柱需要在水樣中加入氫氧化鈉，容易造成水樣中金屬離子的水解沉淀，容易造成管路的堵塞。相比之下MCX柱的平行性比HLB柱和MAX好，回收率大部分在90 %-110%之間，除了恩諾沙星回收率偏低，只有77.41 %。

圖-4. 三種柱子的回收率對比

6. 結(jié)果與討論

6.1 對于16種沙星類化合物在水中的富集方法，應(yīng)考慮實驗過程中基質(zhì)對化合物檢測的干擾。此步的干擾不僅來自于水樣中雜質(zhì)干擾，同時商業(yè)化的固相萃取小柱，使用的色譜級溶液等等都存在干擾雜質(zhì)，因此需要進行基質(zhì)效應(yīng)確認，以避免前處理富集過程中存在基質(zhì)效應(yīng)。

6.2 氮吹濃縮過程中應(yīng)控制吹干程度，不可過分干燥。

6.3 對于沙星類的兩性化合物，在pH=7.0左右時，主要以帶負電荷的形式存在水溶液中，此時進行富集，固相小柱無法對目標物進行吸附。因此需要進行pH調(diào)節(jié)至4.0左右，使其成為帶銨根的正離子，利于下一步進行陽離子交換柱富集。

6.4 淋洗時采用甲酸酸化的水溶液，利于將固相萃取小柱中殘留的EDTA除去，避免其在后續(xù)的洗脫液中干擾沙星類化合物的檢測。