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染色質(zhì)生化研究進(jìn)入條碼測(cè)序時(shí)代
點(diǎn)擊次數(shù)：902 發(fā)布時(shí)間：2014-9-10
帶“條形碼”的半合成核小體（nucleosome）搭配大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（massively parallel sequencing），能夠?yàn)槿祟愄峁┮粋€(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)，用來(lái)分析染色質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)（chromatin-associated proteins）的組蛋白識(shí)別（histone-recognition）及組蛋白修飾（histone-modifying）活性。
科學(xué)家過(guò)去一直認(rèn)為組蛋白的功能非常簡(jiǎn)單，只是在DNA的核內(nèi)包裝過(guò)程中起到一個(gè)架的作用。但是現(xiàn)在他們已經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到了組蛋白，以及組蛋白的各種翻譯后修飾作用（post-translational modifications， PTM）在DNA可接近性（DNA accessibility），以及基因組功能方面所具備的重要的動(dòng)態(tài)調(diào)控功能。
在眾多作用機(jī)制當(dāng)中，組蛋白的PTM可以通過(guò)招募各種效應(yīng)蛋白（effector protein）來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用，這些效應(yīng)蛋白能夠解析在染色質(zhì)上的各種組蛋白PTM狀態(tài)。
經(jīng)過(guò)近20年的科學(xué)研究，科學(xué)家對(duì)這些PTM是如何產(chǎn)生、刪除，以及如何被解讀的機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了比較大的提升，但我們還是不太清楚這些PTM在核小體這種染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單元中發(fā)揮的生化作用是如何被調(diào)控的。
不過(guò)z近在這方面取得了突破，Nguyen等人將天然化學(xué)連接重組核小體技術(shù)（native chemical ligation coupled with recombinant nucleosome technology）與高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing）這兩種在染色質(zhì)生化研究工作中比較成熟的技術(shù)結(jié)合起來(lái)，開發(fā)出了一種功能強(qiáng)大，適用范圍有非常廣的新方法，利用各種打好條形碼的核小體文庫(kù)，就可以確定這些功能復(fù)雜的染色質(zhì)條款因子了。
在發(fā)現(xiàn)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases）具備轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能之后，科學(xué)家們又緊接著利用各種經(jīng)過(guò)修飾的組蛋白多肽（modified histone peptides）開展了一系列對(duì)今后具有重大影響作用的結(jié)構(gòu)研究和生化研究，發(fā)現(xiàn)bromodomain結(jié)構(gòu)域就是一種能夠識(shí)別乙?；?mdash;賴氨酸（acetyl-lysine）結(jié)構(gòu)的基序，在這個(gè)確鑿證據(jù)的支持下，從而將組蛋白PTM與基因活性給了起來(lái)。
后來(lái)由于利用了固定組蛋白多肽（immobilized histone peptides）或各種已標(biāo)記識(shí)別結(jié)構(gòu)域（tagged putative reader domains）的高通量芯片篩查技術(shù)（high-throughput， microarray-based screening）有了進(jìn)一步的發(fā)展，我們?cè)诎l(fā)現(xiàn)PTM識(shí)別結(jié)構(gòu)，以及PTM靶標(biāo)結(jié)構(gòu)等方面又取得了不錯(cuò)的成果，發(fā)現(xiàn)了好些染色之效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，比如惡性腦腫瘤結(jié)構(gòu)域（malignant brain tumor domain）、Tudor結(jié)構(gòu)域和植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain）等。
雖然已經(jīng)取得了這些不錯(cuò)的成績(jī)，了解了一些效應(yīng)蛋白與染色質(zhì)的相互作用機(jī)制，但這主要反映的都是一個(gè)結(jié)構(gòu)域與幾種修飾后的組蛋白多肽之間的相互作用。可是很多效應(yīng)蛋白里都含有好幾個(gè)識(shí)別結(jié)構(gòu)域，每一個(gè)核小體也都含有兩對(duì)核心組蛋白（即H2A、H2B、H3及H4組蛋白），有些核小體里還含有H2A.Z、H2A.X和H3.3等其他組蛋白，這些組蛋白在染色質(zhì)里都有各自*的作用，我們對(duì)此還是知之甚少。核小體和效應(yīng)蛋白的這種組織結(jié)構(gòu)創(chuàng)造出了非常復(fù)雜的染色質(zhì)識(shí)別體系。
比如，一個(gè)含有多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的染色質(zhì)效應(yīng)蛋白就應(yīng)該能夠異性地識(shí)別一個(gè)組蛋白上的多個(gè)不同的PTM，或者位于一個(gè)核小體、或者相鄰核小體上的多個(gè)不同組蛋白上的PTM。實(shí)際上，z近開展的一項(xiàng)研究使用半合成核小體也證實(shí)了，NURF染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體中的BPTF亞基就能夠依靠其自身的bromodomain結(jié)構(gòu)域和植物同源結(jié)構(gòu)域，通過(guò)反式相互作用（trans interactions）分別識(shí)別H4K16ac和H3K4me3這兩種組蛋白PTM。這種依靠核小體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也讓我們能夠在更加符合生理狀態(tài)的條件下，研究染色質(zhì)效應(yīng)蛋白與各種PTM之間的關(guān)系，但低通量是這種方法的缺陷，一次只能研究一個(gè)核小體因子。所以嚴(yán)重阻礙了染色質(zhì)核小體研究工作的進(jìn)展。
圖1 帶有各種已修飾組蛋白的DNL可以被用來(lái)驗(yàn)證組蛋白PTM抗體的異性，研究帶有單個(gè)或多個(gè)識(shí)別結(jié)構(gòu)域的核小體間的相互作用，以及驗(yàn)證酶的組蛋白修飾活性。其基本作用原理都是對(duì)各種實(shí)驗(yàn)富集的核小體上的DNA條形碼進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。
Nguyen等人采用的則是一種現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)版，他們利用表達(dá)蛋白連接技術(shù)（expressed-protein ligation technology）快速地生成了規(guī)模龐大的半合成核小體文庫(kù)，這些半合成核小體的一個(gè)或者多個(gè)組蛋白上全都帶有一個(gè)或者多個(gè)非常明確的、已知的PTM。他們的創(chuàng)新之處就在于使用了帶有*條形碼標(biāo)簽的DNA來(lái)合成人工核小體。
由這些核小體組成的DNA標(biāo)記核小體文庫(kù)（DNA-barcoded nucleosome libraries， DNL）會(huì)被用于具有與染色質(zhì)免疫沉淀（in vitro chromatin immunoprecipitation）體外實(shí)驗(yàn)同樣靈敏度的競(jìng)爭(zhēng)性生化反應(yīng)（competitive in-solution biochemical assay），然后對(duì)實(shí)驗(yàn)所得再進(jìn)行高通量測(cè)序，即用于所謂的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)（圖1）。除了高通量確定組蛋白識(shí)別結(jié)構(gòu)域和修飾因子的PTM異性這一個(gè)作用之外，DNL文庫(kù)技術(shù)還能夠?qū)TM異性抗體進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)際上，抗體的異性是染色質(zhì)研究領(lǐng)域非常關(guān)注的一個(gè)問題，尤其在要求高性全基因組組蛋白PTM分析這個(gè)工作方面更是如此。
Nguyen等人使用這個(gè)技術(shù)平臺(tái)對(duì)BPTF和BRD4這兩種已經(jīng)被研究得非常清楚的組蛋白識(shí)別結(jié)構(gòu)域，以及p300這種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。除了發(fā)現(xiàn)了這些因子之間的已知的相互作用之外，他們還發(fā)現(xiàn)組蛋白H4的多聚乙?；饔茫╬olyacetylation）在招募這些因子時(shí)也起到了非常重要的作用。尤其值得一提的是，p300與多聚乙酰化的H4蛋白之間的結(jié)合進(jìn)一步促進(jìn)了p300對(duì)組蛋白的乙?；揎椬饔?，即起到了一個(gè)正反饋的作用。Nguyen等人還發(fā)現(xiàn)，在H3K4me3核小體中也存在這樣一個(gè)正反饋通路，這也就更進(jìn)一步明確了反式組蛋白相互作用對(duì)p300這樣的染色質(zhì)調(diào)控因子也產(chǎn)生了影響。
在染色質(zhì)研究工作中，建立DNL文庫(kù)是一項(xiàng)重大的進(jìn)步，很有可能會(huì)在不久的未來(lái)帶來(lái)突破性的進(jìn)展。雖然Nguyen等人的工作已經(jīng)非常清楚地證實(shí)了該技術(shù)的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，但是半合成核小體構(gòu)建工作還是存在一些技術(shù)上的難點(diǎn)，需要對(duì)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)相當(dāng)熟練的人才能夠勝任。所以這項(xiàng)技術(shù)是否能夠得到廣泛推廣，我們還需要拭目以待。
除此之外，這種半定量式的方法可能也不太適合解析復(fù)雜的相互作用，比如PTM不對(duì)稱識(shí)別（比如同一個(gè)核小體內(nèi)的H3二聚體分別進(jìn)行了不同的PTM修飾）或者攜帶有不同PTM的兩個(gè)相鄰核小體間的反式相互作用（trans inter-nucleosomal interactions）等。不過(guò)隨著DNL技術(shù)的不斷推廣和應(yīng)用，這些問題在未來(lái)肯定會(huì)得到妥善的解決。無(wú)論如何，這種新技術(shù)在解析復(fù)雜的染色質(zhì)調(diào)控因子招募和作用這個(gè)領(lǐng)域一定會(huì)做出更大的成績(jī)。