RNAi的應(yīng)用前景
 

 RNAi 技術(shù)中的相關(guān)問題主要涉及以下幾點(diǎn)：
 
     （1） dsRNA 序列的選擇dsRNA 主要選自已知的cDNA 的開放閱讀框架（ORF） 中的基因區(qū)域。為防止mRNA 調(diào)控蛋白對RISC 與靶RNA 結(jié)合的干擾,應(yīng)避免選擇包括:1） 起始密碼子下游或終止密碼的50～100 核苷酸位置以內(nèi)的區(qū)域;2） 5′或3′端的非翻譯區(qū)域;3） 內(nèi)含子區(qū)域。此外,序列選擇時(shí)也應(yīng)避開多聚鳥苷酸序列區(qū)（ ≥3 個(gè)） ,因?yàn)檫@樣容易形成四聚體結(jié)構(gòu), 抑制RNAi 作用。選擇與靶mRNA 上序列互補(bǔ)的21～23 個(gè)核苷酸長度的片段,以AA 開頭為佳,因?yàn)榇朔芎喕痙sRNA 合成過程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外,盡量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %（45 %～55 %*） ,高GC 含量能明顯降低基因沉默的效應(yīng)。選擇前可以搜索BLAST數(shù)據(jù)庫,保證無其他與靶基因同源的基因存在,避免引起對其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA 均對RNAi 敏感。為確保靶基因表達(dá)的有效抑制,同時(shí)合成兩個(gè)或以上的針對同一基因的不同靶區(qū)域的dsRNA ;而且,標(biāo)記dsRNA 正義鏈的3′端對RNAi 現(xiàn)象并沒有影響,現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)mRNA 的二級結(jié)構(gòu)對RNAi 有任何顯著的影響。目前,RNAi 技術(shù)主要以哺乳動物細(xì)胞為對象研究其基因的功能。但> 30bp 的dsRNA 在哺乳動物細(xì)胞中會引起干擾素樣效應(yīng),導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。因而直接選用其下游的產(chǎn)物分子siRNA 來代替,達(dá)到基因研究的目的。
 
     （2） dsRNA 的導(dǎo)入方法不同的生物體可以選擇不同的方法。簡單生物,如單細(xì)胞生物等,可選用電穿孔的方法; 較復(fù)雜生物可選用dsRNA 微注射入生殖細(xì)胞或早期胚胎,線蟲也能采用腸道或假體腔注射的方法,與微注射相比,RNAi 效率上并無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養(yǎng)法、磷酸鈣共沉淀法等。若使用的是化學(xué)法人工合成的siRNA（正義鏈和反義鏈） ,還要經(jīng)過退火過程,以雙鏈的形式導(dǎo)入靶細(xì)胞。有人提出了以質(zhì)?；虿《緸檩d體,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染途徑,在細(xì)胞內(nèi)以DNA 為模板,利用RNA 聚合酶Ⅲ,轉(zhuǎn)錄為siRNA（直接形成雙鏈或通過回文序列折疊后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)） ,也能產(chǎn)生較明顯的RNAi 效應(yīng)。zui近,又有一種新的導(dǎo)入方法,就是借助高壓水槍的外力將構(gòu)建的質(zhì)粒直接自小鼠的尾靜脈注入體內(nèi),觀察RNAi 在活體生物模型而不是培養(yǎng)細(xì)胞上的基因沉默效應(yīng) ,但觀察到的siRNA 的半衰期較短,而且由于使用了高壓的外力,過程較復(fù)雜,限制了其在人類疾病治療方面的應(yīng)用。而Pachuk 等則提出了肌注的方法,將針對IL－12 的siRNA 的質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi),得到的RNAi 效應(yīng)更持久。

 
     （3） 發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的siRNA實(shí)驗(yàn)證明,發(fā)夾樣siRNA 能延長在細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間。此類結(jié)構(gòu)可由具有回文序列的核苷酸鏈形成。但通?；匚慕Y(jié)構(gòu)不易獲得,也可用頭碰頭的對稱序列來代替。轉(zhuǎn)錄發(fā)夾樣siRNA 的模板必須與載體轉(zhuǎn)錄啟動子緊密相連,而且盡可能有zui短的多聚腺苷酸尾巴,這樣才能誘導(dǎo)的RNAi 效應(yīng)。Paddison 等提出類似的結(jié)構(gòu)也可應(yīng)用于長片段dsRNA （500bp 左右） ,而不會引起RNA 非特異性的降解。這為檢測哺乳動物細(xì)胞中經(jīng)過長期發(fā)育后的基因功能提供了新的途徑。

 

    RNAi 的應(yīng)用領(lǐng)域及前景：RNAi 是一種的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù),近年來發(fā)展迅速,很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實(shí)驗(yàn)手段將dsRNA 分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi), 特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA ,封閉內(nèi)源性基因表達(dá),從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)分離了果蠅胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路中的各種成分。近來也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道通過RNAi 研究細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前,曾利用反義RNA 與靶mRNA 序列互補(bǔ)的特性來抑制其表型的發(fā)生,但由于反義RNA對內(nèi)源性表達(dá)的基因抑制作用較弱,往往會產(chǎn)生一些過渡表型,易造成對基因功能判斷錯(cuò)誤,目前已通過審批認(rèn)為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物———Vitravene 。RNAi 技術(shù)與之相比,特異性更高,作用更迅速,副反應(yīng)小,在有效地沉默靶基因的同時(shí),對細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)也沒有影響。zui近在人類體細(xì)胞里已經(jīng)成功地對近20 種基因功能進(jìn)行了“敲除”,尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Tsg101 對HIV 在人體內(nèi)增殖的作用,進(jìn)一步深化了對HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰質(zhì)炎病毒為模型,利用RNAi 來誘導(dǎo)細(xì)胞的胞內(nèi)免疫,產(chǎn)生抗病毒效應(yīng),尤其是針對RNA 病毒。對于易突變的病毒,可設(shè)計(jì)多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA ,減少它對dsRNA 的抵抗。Maen 等也應(yīng)用RNAi 技術(shù)成功地阻斷了MCF－7 乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp21 的功能。RNAi 技術(shù)的應(yīng)用,不僅能大大推動人類后基因組計(jì)劃（蛋白組學(xué)） 的發(fā)展,還有可能設(shè)計(jì)出RNAi 芯片,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測人類基因組的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,用RNAi 技術(shù)來抑制基因的異常表達(dá),為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。