亞克隆：細(xì)胞克隆中，對培養(yǎng)的細(xì)胞來說，從原有的克隆中，再篩選出具有某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就是subclone，分為細(xì)胞克隆和分子克隆。

一、亞克隆實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1、掌握細(xì)菌基因組提取的方法和原理。

2、掌握限制性核酸內(nèi)切酶處理基因組及其結(jié)果分析。

3、掌握基因片段回收的方法。

 

二、亞克隆實(shí)驗(yàn)原理

    細(xì)菌基因組的提?。和ㄟ^堿法或者酶法裂解細(xì)菌之后，可以將胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)全釋放出來。DNA溶于1mol/L的NaCl中，不溶于0.14mol/L的NaCl，而RNA溶于0.14mol/L的NaCl不溶于1mol/L的NaCl中，通過溶液中鹽濃度的變化可以將DNA和RNA分開。氯仿－異戊醇法除去蛋白，2倍體積乙醇將DNA沉淀出來。

    限制性核酸內(nèi)切酶只作用于特定的位點(diǎn)，處理基因組后只會得到有限的片斷。通過單酶切或者多酶切后電泳檢驗(yàn)就可以得到與物種本身有關(guān)的特定的圖譜。

    電泳后選定目的基因的條帶，紫外燈下將含有目的基因的凝膠切下，使用凝膠回收試劑盒，將凝膠溶化后，通過吸附柱時，核酸片段就吸附在柱上，洗脫液洗脫后加入2倍體積乙醇，核酸沉淀，TE溶解沉淀，核酸片段得到回收。

 

三、試劑與器材

1、試劑 E.coli JM109，牛肉膏，胰蛋白胨，NaCl，微量細(xì)菌基因組抽提試劑盒（上海生工），BamH I、Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara），NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段（1kb DNA Ladder），凝膠電泳回收試劑盒

2、器材 高速臺式冷凍離心機(jī)，水平電泳儀，漩渦混合儀，紫外檢測儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，微量移液器及吸頭。

 

四、操作方法

1．使用LB培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)菌體。

2．離心收集菌體，根據(jù)試劑盒說明提取基因組。

3．限制性酶處理基因組。

4．E.coli JM109的基因組經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)將酶切圖譜采集下來并對其分析。

5．紫外燈下將需要回收的核酸片段切下來，使用凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

6．電泳檢測回收的核酸片段。

 

五、關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)

1．菌體培養(yǎng)過程要嚴(yán)格無菌，染菌后提取得到的基因組會成多條帶，酶切的圖譜也會比較復(fù)雜。

2．基因組提取過程中所使用的器材要嚴(yán)格滅菌，防止核酸酶降解基因組。

3．基因組提取過程不可以劇烈振蕩，防止DNA斷鏈。

4．在內(nèi)切酶zui適條件下充分處理基因組，得到正確的圖譜。

5．瓊脂糖溶化要充分。

6．切下凝膠時要注意防護(hù)紫外線，電泳結(jié)束之后盡快將膠條切下來，凝膠條要窄，脫尾部分不回收。