第三章 蛋白定量

 

       目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford 法（考馬斯亮藍法）、Lowry 法（Folin-酚試劑法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

       收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據(jù)具體情況選取。

 Bradford 法（考馬斯亮藍法）:

      考馬斯亮藍 G-250 有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍色化合物，該化合物在 595 nm 處有zui大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。

      該法操作簡便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質(zhì)之間差異大，且標準曲線線性差。高濃度的 Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑對測定有干擾。緩沖液濃度過高時，改變測定液 pH 值會影響顯色。

Lowry 法（Folin-酚試劑法）:

      林-酚試劑（Folin-phenol reagent）的顯色原理是：首先在堿性條件下蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅復(fù)合物，該復(fù)合物隨之將磷鉬酸-磷鎢酸還原成藍色復(fù)合物。在一定條件下，藍色強度與蛋白質(zhì)量成正比，蛋白質(zhì)濃度范圍約在 25～250 μg/mL。

     雖然該法是測定蛋白質(zhì)濃度應(yīng)用zui廣泛的方法之一，但其缺點也很明顯，專一性較差，干擾物質(zhì)多（如Tris 緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化物、酚類、檸檬酸等），標準曲線的直線關(guān)系不特別嚴格。因此在其應(yīng)用過程中有很多新的修正。

BCA 法（二喹啉甲酸法）:

      二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法是Lowry測定法的一種改進方法，是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性條件下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍色復(fù)合物，在 562 nm處有高的光吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。

與 Lowery 法相比，BCA 蛋白測定方法操作更簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性更好，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度高（微量檢測可達到 0.5 μg/ml），應(yīng)用更加靈活。與 Bradford 法相比，BCA 法的顯著優(yōu)點是不受去垢劑的影響。

      BCA 法與 Lowry 法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高，且與一系列干擾 Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如 DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其zui主要的缺點是不同的標準品會導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。