第八章 抗體孵育

一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用封閉液稀釋一抗。吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的一抗，室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育 1～2 小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在 4℃緩慢搖動(dòng)孵育一夜。（注意：抗體濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致背景較深，過(guò)低會(huì)導(dǎo)致和抗原結(jié)合不充分，出現(xiàn)假陰性 ）。回收一抗。然后加入 Western 洗滌液，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗的說(shuō)明書，按照適當(dāng)比例用封閉液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動(dòng)孵育 1～2 小時(shí)?；厥斩?。然后加入 Western 洗滌液，在搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。前 2 步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結(jié)合，減少背景。同時(shí)短時(shí)間多次的洗膜（如 5-6 次，每次 3 分鐘）比長(zhǎng)時(shí)間少次數(shù)的洗膜更有效。第 3 步 TBS 洗滌是為了洗去膜上的 Tween-20，因?yàn)樗梢宰璧K底物的沉積。

  注意事項(xiàng)

1. 抗體保存注意事項(xiàng)：

收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進(jìn)行分裝和保存！

對(duì)于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃ 。

分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用完為好，zui少不能少于 10 ul 每份。因?yàn)榉盅b體積越小，抗體的濃度越可能會(huì)受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在 40℃，避免再凍起來(lái)！

避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中。

大部分抗體收到后 40℃短暫保存 1-2 周對(duì)抗體活性是沒(méi)有影響的。長(zhǎng)期保存，加入疊氮納，防止細(xì)菌污染。

2. 一抗/二抗使用問(wèn)題：

   一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說(shuō)明書選擇zui適當(dāng)?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景的深淺。要嚴(yán)格保證反應(yīng)時(shí)間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。

3. 天然和非還原樣品問(wèn)題：

   有些抗體只能識(shí)別的表位是非連續(xù)氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中彼此不連續(xù)，但是在空間結(jié)構(gòu)中則是靠在一起的。這些抗體就只能識(shí)別靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)狀態(tài)（抗體說(shuō)明書中會(huì)有特殊說(shuō)明）。對(duì)于這些樣品，緩沖液和凝膠中就不能含有 SDS，并且不能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行加熱變性。有些抗體只能識(shí)別蛋白的非還原狀態(tài)如氧化狀態(tài)，對(duì)此類樣品，就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑 DTT和 beta-巰基乙醇去除。