技術(shù)文章
第八章 抗體孵育
閱讀:4550 發(fā)布時間:2015-7-14第八章 抗體孵育
一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說明書,按照適當比例用封閉液稀釋一抗。吸盡封閉液后,立即加入稀釋好的一抗,室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動孵育 1~2 小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以在 4℃緩慢搖動孵育一夜。(注意:抗體濃度過高會導(dǎo)致背景較深,過低會導(dǎo)致和抗原結(jié)合不充分,出現(xiàn)假陰性 )。回收一抗。然后加入 Western 洗滌液,在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說明書,按照適當比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。吸盡洗滌液后,立即加入稀釋好的二抗,室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動孵育 1~2 小時?;厥斩埂H缓?/span>加入 Western 洗滌液,在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。前 2 步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結(jié)合,洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺,所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結(jié)合,減少背景。同時短時間多次的洗膜(如 5-6 次,每次 3 分鐘)比長時間少次數(shù)的洗膜更有效。第 3 步 TBS 洗滌是為了洗去膜上的 Tween-20,因為它可以阻礙底物的沉積。
注意事項
1. 抗體保存注意事項:
收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝和保存!
對于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃ 。
分裝的量以一次實驗用完為好,zui少不能少于 10 ul 每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在 40℃,避免再凍起來!
避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。
大部分抗體收到后 40℃短暫保存 1-2 周對抗體活性是沒有影響的。長期保存,加入疊氮納,防止細菌污染。
2. 一抗/二抗使用問題:
一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇zui適當?shù)谋壤?,一抗二抗的選擇直接影響實驗結(jié)果以及背景的深淺。要嚴格保證反應(yīng)時間,洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈,有利于降低背景;還要注意一抗二抗的匹配。
3. 天然和非還原樣品問題:
有些抗體只能識別的表位是非連續(xù)氨基酸,這些氨基酸雖然在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中彼此不連續(xù),但是在空間結(jié)構(gòu)中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)狀態(tài)(抗體說明書中會有特殊說明)。對于這些樣品,緩沖液和凝膠中就不能含有 SDS,并且不能夠?qū)Φ鞍走M行加熱變性。有些抗體只能識別蛋白的非還原狀態(tài)如氧化狀態(tài),對此類樣品,就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑 DTT和 beta-巰基乙醇去除。