Western Blotting（蛋白印跡雜交）又稱免疫印跡（immunoblotting），是利用抗原抗體反應(yīng)，進(jìn)行蛋白檢測的常用方法之一。Western Blot方法非常成熟，大多實驗室均具備Western Blot的實驗?zāi)芰?。但是要得到一份背景清晰、條帶明亮、真實客觀的實驗結(jié)果，需要投入大量的時間和精力，鐘鼎生物技術(shù)人員，在樣品處理、轉(zhuǎn)印和抗體稀釋比例等操作上具有特殊的技巧，能夠為客戶的樣品量身定制實驗方案。

 western blot檢測 實驗流程

　　1、蛋白質(zhì)抽提

　　A、實驗對象為組織樣品，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白。

　　B、實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。

　　2、蛋白質(zhì)定量

　　按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

　　3、變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)

　　將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個孔中，電泳分離蛋白。

　　4、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜

　　5、膜的封閉和抗體孵育

　　A、膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。

　　B、封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。

　　C、加入HRP標(biāo)記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。

　　6、結(jié)果檢測

　　化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。

　　7、數(shù)據(jù)分析

　　目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

　　8、提供實驗報告

　　包括詳細(xì)的實驗方法及Western Blot實驗結(jié)果。