詳細介紹
腺病毒(Adenovirus)是目前可靠的重組病毒表達系統(tǒng)之一,可用于在哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白。其具備以下優(yōu)點:
1. 宿主范圍廣。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞,除可感染幾乎所有人的細胞類型外,還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
2. 因腺病毒的感染不依賴細胞周期,故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞。
3. 腺病毒具有嗜上皮細胞特性,因大多數(shù)腫瘤細胞均屬于上皮細胞,這使得腺病毒非常適合應用于基因治療領域。
4. 病毒滴度高,可用于動物水平的實驗。
5. 有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細胞基因組中;實驗中雖然會有一定機率出現(xiàn)RCA(即復制型腺病毒),但由于大多數(shù)成人體內都有針對腺病毒的抗體,所以一般危害不大。
技術要點
重組腺病毒的包裝制備:重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位(pfu)中分離獲得的。一個單色斑是線性載體質粒轉染后在20×15 cm板上由293A細胞連續(xù)侵染后被挑選和擴增形成的。重組腺病毒可通過超速離心純化,并測定滴度及進行PCR鑒定。純化后重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml,獲得的量為2-4 ml。
重組腺病毒的特性:一般的,單個腺病毒通常是在30×150mm細胞培養(yǎng)皿中制備的。
獲得量:1×10病毒顆粒/細胞
滴定濃度:1×1010~1×1012個病毒基因組/ml
zui終體積:1 ml純化后的病毒液(儲存于PBS)
儲存:批量儲存的*條件為-80°C
幾種病毒載體的區(qū)別:
腺病毒表達系統(tǒng) | 慢病毒表達系統(tǒng) | 逆轉錄病毒 | |
病毒基因組成 | 雙鏈DNA | 單鏈RNA | 單鏈RNA |
載導容量 | < 8 kb | < 8 kb | < 6kb |
基因整合功能 | 無。病毒基因組游離于宿主基因組外,瞬時表達外源基因 | 有。病毒基因組整合于宿主基因組,長時間、穩(wěn)定表達外源基因 | 有。 |
表達豐度 | 高水平表達 | 中 | 中 |
表達時間 | 快(1-2天) | 慢(2-4天) | 快(1-2天) |
感染細胞類型 | 分裂和不分裂細胞 | 分裂和不分裂細胞。適用于難轉染細胞 | 感染分裂細胞,但在干細胞中表達效率低 |
滴度TU/ml | 10^12 | 10^9 | 10^9 |
四環(huán)素誘導系統(tǒng) | 不可以 | TET-ON , TET-OFF | 不可以 |
毒性作用 | 細胞毒性 | 遺傳毒性 | 遺傳毒性 |
免疫原性 | 高免疫原性 | 低免疫原性 | 低免疫原性 |
動物模型 | 不能得到轉基因動物 | 可產生轉基因動物,效率達50以上 | 可以,但很難 |
安全系數(shù) | 高 | 高 | 中 |
能否用于MIRCORNA | 可以 | 可以 | 不可以 |
RNAi | 病毒進入細胞往往引起細胞內干擾素反應,不適合做RNAi實驗 | 適合,是RNAi實驗的優(yōu)選工具 | 可以用作RNAi實驗 |
基因過表達 | 包裝容量較大??梢詽M足較大基因的包裝,是過表達基因的優(yōu)選工具 | 包裝容量有限,過表達的基因過大時,病毒滴度受到影響 | 包裝容量有限,過表達的基因過大時,病毒滴度受到影響 |
常見應用 | 1、體外細胞基因轉導2、基因治療 | 1、體外細胞基因轉導2、基因治療 |