NovoRec® PCR一步定向克隆試劑盒（無(wú)縫克?。┦墙兜鞍踪|(zhì)科技研發(fā)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品可以不依賴于連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點(diǎn)限制，而直接用同源重組的方法，完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，PCR產(chǎn)物一步定向克隆，目的片段與載體無(wú)縫連接，反應(yīng)時(shí)間短至20分鐘，陽(yáng)性率達(dá)到95%以上，讓您輕松完成實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品介紹

NovoRec® PCR一步定向克隆試劑盒(無(wú)縫克隆)是近岸蛋白質(zhì)科技研發(fā)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品可以不依賴于連接酶，不受載體和目的片段的酶切位點(diǎn)限制，而直接用同源重組的方法，完成目的片段與載體相連接的基因克隆技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，PCR產(chǎn)物一步定向克隆，目的片段與載體無(wú)縫連接，反應(yīng)時(shí)間短至20分鐘，陽(yáng)性率達(dá)到95%以上，讓您輕松完成實(shí)驗(yàn)。

反應(yīng)原理

· 產(chǎn)品組成、穩(wěn)定性及保存條件
1、產(chǎn)品組成

2、穩(wěn)定性：此Kit在4℃保存3天不影響使用效率。
3、保存條件：收到后請(qǐng)立即離心；此kit可在-20℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。

· 使用方法
A.線性化載體的獲得
線性化載體可以通過(guò)兩種方法獲得，不管采取哪種方法，zui終線性化載體的濃度需>15ng/ul。(高濃度的載體有利于提高效率)。
1、酶切
選取合適的位點(diǎn)，單酶切或雙酶切皆可，并且5’端突出，3’端突出或平末端均適用本Kit。為了提高陽(yáng)性率，我們建議您采取雙酶切載體。
2、PCR
選取合適的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)正向和反向引物，引物長(zhǎng)度一般在18-20bp左右，一般載體長(zhǎng)度均大于3kb，建議用高保真的聚合酶擴(kuò)增（推薦使用novoprotein pfu DNA 聚合酶，貨號(hào)：E002）。為了避免模板質(zhì)粒DNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的影響，建議載體酶切后再用PCR擴(kuò)增，自連背景更低，陽(yáng)性率更高。

B.目的片段獲得
目的片段通常通過(guò)PCR獲得。引物設(shè)計(jì)要保證目的片段兩端有至少15bp序列與線性化載體的兩端*，特殊應(yīng)用引物設(shè)計(jì)請(qǐng)參照技術(shù)手冊(cè)。 為保證PCR擴(kuò)增的特異性及靈敏度，請(qǐng)盡可能選用pfu等高保真酶（推薦使用novoprotein pfu DNA 聚合酶，貨號(hào)：E002）。PCR每條引物長(zhǎng)度至少在35-40bp，包括5’端與載體同源的15bp以及目的片段特異性序列20-25bp，（注意事項(xiàng)：如果是表達(dá)載體克隆構(gòu)建，引物設(shè)計(jì)*后，請(qǐng)注意檢查讀碼框的正確）。
引物設(shè)計(jì)方法：
使用NovoRec PCR一步定向克隆試劑盒時(shí)，引物設(shè)計(jì)是很重要的，在設(shè)計(jì)引物時(shí)同樣要遵循引物設(shè)計(jì)的基本原則，只不過(guò)上下游引物要加上15-18bp的載體同源序列。

C.目的片段與載體的重組
1.將目的DNA和線性化載體以一定的摩爾比加到管子中進(jìn)行重組反應(yīng),摩爾比可計(jì)算方法見(jiàn)下述NovoRec在線計(jì)算表。
2. 混勻后在37℃放置20分鐘;
3.立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，剩余連接液可保存在4℃或-20℃待用。
注意：1.目的片段與載體的摩爾比在3：1-10：1之間，摩爾比低于3：1效率會(huì)降低   
      2.反應(yīng)時(shí)間在20-40分鐘，時(shí)間太長(zhǎng)不利于重組反應(yīng)

D.轉(zhuǎn)化
我們建議所使用的感受態(tài)細(xì)胞效率要達(dá)到或>5X106 cfu/μg.
1.  冰上融化一管100 μl的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管壁使細(xì)胞重懸起來(lái)。加入10μl的反應(yīng)液到感受     態(tài)細(xì)胞中，輕彈數(shù)下，置冰上孵育45分鐘。
2.  42℃水浴中熱激90秒后快速放入冰上5分鐘。
3.  加入500μl SOC液體培養(yǎng)基，37℃孵育45-60分鐘。
4.  5k離心3分鐘收集菌體，根據(jù)需要將一定量的菌體均勻的涂布在含抗生素平板上。

E.陽(yáng)性克隆鑒定
一般的，我們建議采用菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定(推薦使用Novoprotein 2x specific  Mater Mix 貨號(hào)：E010)。
鑒定引物的選擇：為避免假陽(yáng)性結(jié)果，我們建議一條引物為載體特異性引物，另一條引物為目的片段特異性引物。