微生物培養(yǎng)基的制備步驟總共分為九步，每一步是如何操作的呢?接下來咱們就細(xì)細(xì)分解。

• 步 稱取

用度1/100的電子天平稱取培養(yǎng)基所需藥品。先根據(jù)配方計(jì)算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量，然后用天平準(zhǔn)確稱取。稱量時(shí)用稱量紙折疊成簸箕狀盛放藥品。稱量紙折疊方法如圖所示。

• 第二步 溶化

培養(yǎng)基放入燒杯中，慢慢加入少量所需水，邊加入邊用玻棒攪拌。如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂，培養(yǎng)基不需要加熱;如果含有瓊脂，則需要用本生燈或電磁爐加熱煮沸，*溶解后，再補(bǔ)齊所需水，并攪拌均勻(如圖3所示)。如果配制的培養(yǎng)基量很大，可用不銹鋼鍋加熱溶化，可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng)，防止焦化，如有焦化現(xiàn)象，配制的培養(yǎng)基就不能使用，要重新配制。

配制培養(yǎng)基時(shí)不可用銅或鐵的容器溶化，因銅或鐵制容器可能會(huì)使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量超標(biāo)，影響實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)基中銅含量大于0.3mg/L，細(xì)菌不宜生長(zhǎng)，鐵含量超過0.14mg/L，妨礙細(xì)菌產(chǎn)毒素)。對(duì)容易發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀的藥品，要分開溶解，后加入培養(yǎng)基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂。

• 第三步 調(diào)pH

雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分，能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi)，但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求，就要進(jìn)行必要的調(diào)整。如果有已校準(zhǔn)pH計(jì)，可用pH計(jì)，如果沒有，可用精密的pH試紙，再根據(jù)需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸(微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸)調(diào)制所需的pH。

培基的pH一般為7.4～7.6，也有酸性或堿性的。用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基，在調(diào)整pH時(shí)要調(diào)至高出所需0.1個(gè)～0.2個(gè)單位，因用氫氧化鈉調(diào)整時(shí)，高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH要降低0.1~0.2。如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分，可不用調(diào)pH。

• 第四步 過濾

配成的培養(yǎng)基，若無特殊要求，可省略此步。若有沉淀或渾濁需要澄清的液體培養(yǎng)基可用油紙過濾。而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過濾。如果過濾法還不能達(dá)到澄清的要求，則可用蛋清澄清法，即培養(yǎng)基加熱冷卻到50~60℃，裝入三角瓶?jī)?nèi)(不超過容量的二分之一)，按1000mL加人1個(gè)～2個(gè)雞蛋的蛋清，用力搖晃3-5min，高壓蒸汽滅菌121℃、20min，取出趁熱過濾即可。

• 第五步 分裝

配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中，分裝試管，如果試管量很大，可用自動(dòng)分液器，如果試管量少，可用漏斗分裝。

分裝量不超過容器容積的三分之二。三角瓶以不超過容積的二分之一為宜;

瓊脂斜面以不超過試管長(zhǎng)度的五分之一為宜，滅菌后，擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一，底層為三分之二的量為宜;

半固體瓊脂分裝量為試管長(zhǎng)度的三分之一;

用來接種或保菌的高層瓊脂，分裝量為試管長(zhǎng)度的四分之一或三分之一，用來接種厭氧菌的要達(dá)到三分之二;

瓊脂平板，內(nèi)徑為90mm的以13mL~15 mL為宜，內(nèi)徑70mm的平板為8mL~10 mL，制成的瓊脂平板若表面水分較多，可將平板倒扣，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min，干燥后再用。

每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝一小玻璃瓶(約20mL)與該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，為測(cè)定該批培養(yǎng)基終pH。

• 第六步 滅菌

分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)立即進(jìn)行滅菌。滅菌的方法種類如下：

1.高壓蒸汽滅菌法

大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法，小量分裝時(shí)，用121℃，15min;滅菌量大時(shí)，用121℃，30min滅菌;含糖類的培養(yǎng)基只能113~115℃，15min滅菌，避免糖類遭破壞。

2.煮沸滅菌法

對(duì)含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基，可使用此方法。

3.過濾除菌

以過濾的方法除菌，用無菌操作技術(shù)，定量加入培養(yǎng)基。血液、抗生素可用無菌操作技術(shù)抽取，加入冷卻到50℃左右的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時(shí)，可用此法。

對(duì)LST培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，有時(shí)發(fā)酵管內(nèi)會(huì)有氣泡。為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡，可以采取以下幾項(xiàng)措施：

1. 小倒管浸滿培養(yǎng)基(不留氣泡)后再加入到盛LST的試管中。

2.滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前，將鍋內(nèi)氣體排干凈。

3.試管塞不要塞得太緊(使用硅膠塞的時(shí)候)，勿使用橡皮塞。

4.不要過早打開滅菌鍋，要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時(shí)再打開滅菌鍋。

如果以上情況都做到還有氣泡，可用水做培養(yǎng)基組的對(duì)照試驗(yàn)，若培養(yǎng)基組有氣泡，而對(duì)照組沒有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因。

• 第七步 倒平板

滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃后，倒入無菌干燥的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基的溫度不能過高，否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水;溫度太低，培養(yǎng)基又容易凝固成塊，無法制成平板。

倒平板時(shí)，應(yīng)在靠近酒精燈火焰進(jìn)行，以免外界的雜菌落入平板內(nèi)，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下，灼燒瓶口，用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開一條縫，至瓶口剛好伸入，倒入培養(yǎng)基，以鋪滿底為限，不超過培養(yǎng)皿高度的三分之一，迅速蓋好蓋，放在桌面上，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基分布均勻，冷凝后即可。

• 第八步 擺斜面

裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基，在滅菌完成后，趁熱立即擺放在木棒(或玻璃棒)上，并成適當(dāng)?shù)男倍?，冷卻后，瓊脂凝固即成斜面。斜面長(zhǎng)度不用超過試管二分之一。

• 第九步 質(zhì)量檢查

培養(yǎng)基滅菌后仔細(xì)檢查一遍，發(fā)現(xiàn)有破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染，都要丟棄，不能再用。并測(cè)定其終pH。還需進(jìn)行無菌檢查和效果檢查。無菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管(瓶)~2管(瓶)，37℃恒溫培養(yǎng)1d～2d，確定無雜菌生長(zhǎng);效果檢查是用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相關(guān)的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長(zhǎng)、形態(tài)及生化情況，與已知情況相符。兩種情況都合格，配制的培養(yǎng)基方可使用。