氨基酸的水解類型詳解

1.1 水解類型

肽和蛋白質(zhì)由通過(guò)肽鍵結(jié)合在一起的許多氨基酸組成。這些生物分子繼而構(gòu)成許多不同的樣品，諸如生物治療藥物、食品和飼料。為分析這些生物分子中所包含的氨基酸，使鍵水解以形成游離氨基酸至關(guān)重要。但在該過(guò)程中，偶聯(lián)氨基酸鍵的不同化學(xué)性質(zhì)可能影響氨基酸鍵的裂解效率以及單個(gè)氨基酸的回收率。例如，水解過(guò)程中氨基酸的回收率會(huì)受到特定化學(xué)反應(yīng)、試劑基質(zhì)干擾物和氨基酸本身穩(wěn)定性的影響。

鑒于樣品和氨基酸的化學(xué)及物理性質(zhì)存在很大差異，多年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出不同的水解程序。這些程序因反應(yīng)類型（化學(xué)或酶促反應(yīng)）、化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)（酸或堿）和反應(yīng)的物理狀態(tài)（液相或氣相）而異。這些差異會(huì)影響特定氨基酸（可能被特定試劑破壞）的回收率或水解所需的效率和時(shí)間。在一些情況下，可能需要采用多種水解程序以確定樣品的總氨基酸含量。常見(jiàn)的化學(xué)水解反應(yīng)類型和水解模式如下所述。

注：酶水解是一種不常用的程序，本文檔未作介紹。

還需注意的是，許多化學(xué)水解反應(yīng)可以使用不同類型的設(shè)備進(jìn)行。過(guò)去，水解程序在真空下使用熱源以確保反應(yīng)完成，但隨著更現(xiàn)代化的設(shè)備推出，微波誘導(dǎo)水解也得到了廣泛應(yīng)用。每種方法的優(yōu)勢(shì)各不相同，應(yīng)當(dāng)在選擇設(shè)備之前加以考察。

1.1.1 酸水解

酸水解是水解蛋白質(zhì)樣品的最常用方法，該方法可以在氣相或液相中進(jìn)行。盡管該反應(yīng)可以使用一系列不同的酸，但最常用的是6 M鹽酸。由于鹽酸具有蒸發(fā)性，也可以用于回收少量緩沖液中的水解產(chǎn)物，處理少量樣品時(shí)這一特性非常有用。此外，鹽酸的通用性使其可用于液相或氣相水解。

采用6 M鹽酸的酸水解反應(yīng)導(dǎo)致向每個(gè)共價(jià)肽鍵中添加水，從而得到所需的單個(gè)氨基酸（圖1）。但是，并非所有氨基酸在鹽酸水解下都能完全回收。一些氨基酸會(huì)水解為酸形式：例如天冬酰胺和谷氨酰胺分別形成天冬氨酸和谷氨酸。此外，其他氨基酸無(wú)法得到可靠的測(cè)量。例如，色氨酸在反應(yīng)過(guò)程中被破壞，而含硫氨基酸（例如，半胱氨酸、蛋氨酸）由于氨基酸被部分破壞而無(wú)法得到可靠的測(cè)量。此外，由于酸水解的性質(zhì)，酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等氨基酸的回收率可能較低。

圖1.蛋白質(zhì)的酸水解

但是，如果經(jīng)過(guò)預(yù)處理，一些含硫氨基酸（例如，半胱氨酸、蛋氨酸）可以在用鹽酸酸水解時(shí)得以保留。為準(zhǔn)確定量分析這些氨基酸，可以在用鹽酸酸水解之前對(duì)樣品進(jìn)行氧化或烷基化。對(duì)于氧化，在用鹽酸酸水解之前，通常用過(guò)甲酸將含硫氨基酸氧化。由此導(dǎo)致這些氨基酸的氧化形式得到準(zhǔn)確定量。也可以通過(guò)烷基化保留含硫氨基酸（半胱氨酸），從而準(zhǔn)確定量其烷基化形式。兩種最常用的烷基化試劑產(chǎn)生兩種形式的半胱氨酸，即吡啶乙基半胱氨酸或羧甲基半胱氨酸。這種烷基化過(guò)程的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它不影響其他氨基酸。

最后，鑒于利用鹽酸水解難以定量分析某些氨基酸，針對(duì)特定氨基酸可采用替代酸水解技術(shù)。一種技術(shù)使用磺酸（例如甲磺酸(MSA)）來(lái)定量分析色氨酸和蛋氨酸（呈亞砜的形式）。雖然這種試劑是非揮發(fā)性的，但它能夠保留色氨酸和蛋氨酸亞砜以進(jìn)行定量。

1.1.2 堿水解

雖然用鹽酸酸水解是迄今為止十分常用的水解蛋白質(zhì)和肽的技術(shù)，但色氨酸的測(cè)量通常使用堿水解。由于色氨酸在堿性條件下保持穩(wěn)定，因此該技術(shù)可準(zhǔn)確定量色氨酸，并且廣泛用于從食品和飼料到肽和蛋白質(zhì)的各種樣品。堿水解通常使用NaOH或KOH作為試劑。但是，堿水解不能代替酸水解來(lái)定量分析所有氨基酸。在堿性條件下，精氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸被破壞，無(wú)法定量。其他氨基酸也受到影響，因此堿水解通常僅用于色氨酸。

1.2 水解模式

水解反應(yīng)在液相或氣相中進(jìn)行。無(wú)論采用哪種水解模式，專門設(shè)計(jì)用于水解的儀器都將促進(jìn)反應(yīng)。過(guò)去，許多水解反應(yīng)在高溫和真空下進(jìn)行數(shù)小時(shí)至數(shù)天，但是隨著微波水解儀器的出現(xiàn)，相同的過(guò)程在較低溫度下只需數(shù)分鐘即可完成。

1.2.1 液相水解

在液相水解中，樣品和鹽酸都直接加入水解管中進(jìn)行反應(yīng)。該程序需要將樣品、內(nèi)標(biāo)和酸直接加入水解管中。將水解管用氮?dú)鉀_洗，然后密封并在完成水解所需的時(shí)間內(nèi)持續(xù)加熱。液相水解可能需要數(shù)小時(shí)到數(shù)天才能完成。該程序通常用于較復(fù)雜的樣品。

1.2.2 氣相水解

在氣相水解中，樣品僅與氣相鹽酸發(fā)生反應(yīng)。該程序需要將樣品和內(nèi)標(biāo)（如果使用）放入水解管中。然后將樣品干燥，并將每個(gè)試管敞開(kāi)放入水解容器中。將酸（6 M鹽酸）加入裝有水解管的容器底部，然后將容器密封并抽真空，再用氮?dú)鉀_洗。在完成水解所需的時(shí)間內(nèi)持續(xù)加熱容器。該模式減少了來(lái)自任何不純?cè)噭ɡ琨}酸）的污染。氣相水解通常以快于液相水解的速率發(fā)生。在氣相水解中，通常需要樣品具有高純度。