氨基酸定量分析

7.1 簡(jiǎn)介

盡管本指南大體上集中在氨基酸分析的初始步驟（重點(diǎn)在水解樣品制備），但本節(jié)還是簡(jiǎn)要討論了氨基酸分析中更常用的定量方法。在這些示例中，我們獲得了氨基酸分析結(jié)果；分析中需要計(jì)算原始樣品濃度。在這些示例中，我們假設(shè)已使用AccQ•Tag或AccQ•Fluor試劑進(jìn)行了衍生化處理。

在進(jìn)行定量之前：

• 驗(yàn)證是否已正確鑒別所有峰。

• 如果保留時(shí)間不匹配，請(qǐng)檢查校正表中的值。

• 檢查所有峰的積分是否正確。

7.2 氨基酸的絕對(duì)定量

7.2.1 樣品中蛋白質(zhì)的濃度

在某些分析中，分析目標(biāo)只是測(cè)定分析樣品的濃度。測(cè)定結(jié)果通常以摩爾濃度表示，例如µmol/L。色譜結(jié)果通常以皮摩爾為單位。要測(cè)定濃度，請(qǐng)將色譜軟件報(bào)告的氨基酸皮摩爾量除以進(jìn)樣體積，然后將該值乘以稀釋劑體積，再除以衍生化體積。將該值乘以稀釋因子，然后將單位換算為µmol/L，計(jì)算完成。

計(jì)算示例：
要確定原始樣品中氨基酸的濃度，請(qǐng)將報(bào)告的值用于以下公式：

其中：

pmol AA = 樣品中氨基酸的報(bào)告量

Vi = 進(jìn)樣體積(µL)，通常為1 µL

Vd = 衍生化體積(µL)，通常為10 µL

Vr = 用于復(fù)溶樣品的稀釋劑的體積(µL)

Dil. Factor = 稀釋因子

示例：

將初始的100 µL水解蛋白質(zhì)樣品用內(nèi)標(biāo)按1:1稀釋。將10 µL等分試樣進(jìn)行衍生化處理。進(jìn)樣體積為1 µL，天冬酰胺(Asn)的報(bào)告值為312.5 pmol。

Asn的濃度(µmol/L)為：

7.3 氨基酸的相對(duì)定量

水解蛋白質(zhì)中氨基酸組分的測(cè)定涉及樣品中組分摩爾比的計(jì)算。

每種純蛋白質(zhì)對(duì)其中包含的每種氨基酸均具有特定的殘基化學(xué)計(jì)量數(shù)。理想情況下，分析結(jié)果得到的摩爾比為整數(shù)。觀測(cè)值接近該理想值的程度受蛋白質(zhì)或肽的純度、水解條件是否充分，以及氨基酸分析質(zhì)量的影響。

7.3.1 計(jì)算肽組分

示例1（如下表所示）：

1. 將各氨基酸的觀測(cè)皮摩爾量（從分析中獲得）列成表格。

2. 檢查并估算各氨基酸的殘基數(shù)（估算組分）。注意：觀察到的殘基是每種氨基酸的相對(duì)摩爾濃度。將所有觀測(cè)皮摩爾值除以豐度最低的氨基酸摩爾量，并四舍五入到最接近的數(shù)字。

3. 將所有氨基酸的皮摩爾值和殘基數(shù)相加。

4. 將觀測(cè)總皮摩爾數(shù)除以估算組分的總和來(lái)計(jì)算每個(gè)殘基的平均pmol（pmol/殘基）。

5. 將每個(gè)觀測(cè)皮摩爾值除以pmol/殘基值以確定觀測(cè)組分。

平均pmol/殘基

警告：對(duì)于較大的蛋白質(zhì)，由于需要更高的精度，因此更難以估算殘基數(shù)。

警告：某些氨基酸的水解回收率可能會(huì)變化（Ser、Tor、Tyr和Met會(huì)降解；Val和Ile鍵可能難以斷裂）。

注：為了在這類(lèi)情況下改善定量，建議進(jìn)行時(shí)程研究。通常，可將樣品水解24 h、48 h和72 h（或96 h）；不穩(wěn)定的氨基酸值可通過(guò)外推回零時(shí)間來(lái)確定，而Ile和Val的值可從時(shí)間最長(zhǎng)的水解中獲得。

示例2：
在一些情況下，如前所述，可以使用摩爾百分比（每100個(gè)蛋白質(zhì)殘基中各氨基酸的殘基數(shù)）計(jì)算結(jié)果。測(cè)定方法如下：

7.3.2 估算蛋白質(zhì)分子量

如果可以估算蛋白質(zhì)的分子量，則可以使用兩種方法來(lái)計(jì)算大致組分：

7.3.2.1 基于氨基酸大小和總產(chǎn)物量計(jì)算組分

1. 估算的樣品分子量(MW)。

2. 將氨基酸的總產(chǎn)物量相加(pmol)。

3. 將分子量除以110（氨基酸的平均分子量）。注：由此可計(jì)算得出非常接近總鏈長(zhǎng)或氨基酸總量的值。

4. 將總產(chǎn)物量除以鏈長(zhǎng)（等于進(jìn)樣的摩爾量）。

5. 將每種氨基酸的量除以進(jìn)樣的摩爾量（等于每摩爾的殘基數(shù)）。檢查該值與整數(shù)量的偏差。

6. 稍微向上或向下調(diào)整除數(shù)（進(jìn)樣的摩爾量），盡可能減小與整數(shù)值（步驟5中獲得）的偏差。可利用計(jì)算機(jī)電子表格程序或?qū)俣ㄖ频陌被彳浖页鲎钚∑?，?jiǎn)化該步驟。

7. 請(qǐng)記住，由于水解回收率低，不穩(wěn)定的氨基酸和穩(wěn)定鍵合形成物的值可能會(huì)顯著偏離整數(shù)值。

7.3.2.2 基于歸一化至單個(gè)氨基酸計(jì)算組分

這種替代方法需要有關(guān)樣品的更多知識(shí)。

1. 在分析中選擇滿(mǎn)足以下兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸：

• 在水解和衍生化時(shí)產(chǎn)率高（例如，Asp、Glu、His、Arg、Ala、Pro、Leu、Phe、Lys）。不建議選擇Gly，因?yàn)樗且环N常見(jiàn)的背景污染物；

• 每摩爾樣品可能僅含有幾個(gè)殘基（基于估算的樣品分子量和氨基酸產(chǎn)量）。這些信息可以從其他方法中獲得，例如溴化氰水解，溴化氰可在蛋氨酸處選擇性地切割完整的多肽鏈。

2. 基于這些信息，為該氨基酸選擇一個(gè)整數(shù)值。

3. 將所選氨基酸的產(chǎn)量除以所選整數(shù)值，即可得到估算的進(jìn)樣摩爾量。

4. 按照第7.3.2.1節(jié)步驟5和6操作。

5. 檢查得出的值（一個(gè)小于和一個(gè)大于所選整數(shù)的值），確定它們與整數(shù)的偏差是否減小。

7.3.2.3 計(jì)算肽/蛋白質(zhì)濃度

將每個(gè)氨基酸的皮摩爾數(shù)與其相應(yīng)的分子量的乘積相加，計(jì)算原始樣品中肽或蛋白質(zhì)的濃度。

使用第7.3.1節(jié)表格中引用的示例，開(kāi)始按照以下方法計(jì)算：

計(jì)算示例：

對(duì)于樣品中的Asp（天冬酰胺）：分子量為133.10 g/moL的氨基酸的觀測(cè)含量為220皮摩爾，如下所示：

對(duì)于其他所需的氨基酸，該計(jì)算方法也適用。下表顯示了計(jì)算得出的每種氨基酸的皮克數(shù)值，右下角顯示了樣品中進(jìn)樣的蛋白質(zhì)的皮克數(shù)值總和。

注入蛋白質(zhì)的皮克數(shù)總和

7.4 飼料中氨基酸的定量分析

在食品和飼料分析中，上述計(jì)算值也適用。然而，對(duì)大多數(shù)飼料分析而言，更重要的信息是一些特定的、限制動(dòng)物生長(zhǎng)的氨基酸（例如蛋氨酸和半胱氨酸）含量。最常引起關(guān)注的值是樣品中的氨基酸含量（重量百分比）。

7.4.1 計(jì)算食品/飼料中氨基酸的重量百分比

要計(jì)算氨基酸的重量百分比：

計(jì)算示例：

步驟1：將報(bào)告的氨基酸摩爾濃度換算為報(bào)告的含量(g/mL)。

報(bào)告的含量值(pmol/µL)須乘以殘基分子量(gm/mol)和換算系數(shù)。

步驟2：將報(bào)告的每種氨基酸的含量換算為重量。

然后將報(bào)告的含量(g/mol)乘以稀釋因子。再將結(jié)果除以樣品的重量并乘以100，即可換算為重量百分比。

計(jì)算示例：

其中：

    含量 = 氨基酸的含量，g/mL

    稀釋因子 = 樣品稀釋因子

步驟3：將報(bào)告的每種氨基酸的含量換算為重量百分比。

樣品重量以mg為單位

7.4.2 官方AOAC方法994.12"飼料中的氨基酸"：計(jì)算樣品中氨基酸的重量百分比

該方法需要使用內(nèi)標(biāo)。

計(jì)算示例：

步驟1：計(jì)算每種氨基酸的響應(yīng)因子(RFaa)。

將內(nèi)標(biāo)的峰面積乘以氨基酸的重量(mg)。然后將計(jì)算值除以氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)重量相乘的值。

其中：

    RF_aa = 氨基酸的響應(yīng)因子

    P_n = 內(nèi)標(biāo)的峰面積

    P_aa = 樣品中氨基酸的峰面積

    W_aa = 氨基酸重量(mg)

    W_n = 內(nèi)標(biāo)重量(mg)

步驟2：計(jì)算內(nèi)標(biāo)(IS)因子。

步驟3：確定氨基酸的重量百分比。

開(kāi)始計(jì)算含量百分比：將氨基酸峰面積乘以計(jì)算出的響應(yīng)因子，然后將該值乘以?xún)?nèi)標(biāo)因子。將結(jié)果除以?xún)?nèi)標(biāo)峰面積和分析樣品重量的被乘數(shù)。然后將結(jié)果值換算為百分比。

其中：

    P_aa = 氨基酸峰面積

    P_n = 內(nèi)標(biāo)峰面積

    RF_aa = 計(jì)算出的響應(yīng)因子

    IS = 計(jì)算出的內(nèi)標(biāo)因子

示例：

對(duì)于飼料樣品中的氨基酸，已確定以下值：

    氨基酸重量(W_aa) = 0.5 mg

    氨基酸峰面積(P_aa) = 100,000

    內(nèi)標(biāo)峰面積(P_n) = 110,000

    內(nèi)標(biāo)重量(W_n) = 0.5 mg

    待測(cè)樣品的重量(W_s) = 10 mg

步驟1：計(jì)算響應(yīng)因子(RF_aa)：

步驟2：計(jì)算內(nèi)標(biāo)因子(IS)：

0.5 mg × 2 × 10-2 = 0.05

步驟3：通過(guò)計(jì)算出的兩個(gè)值，即可確定氨基酸的百分比：

在飼料中，目標(biāo)氨基酸的重量百分比為0.9%。